عزل الخلايا التائية القاتلة الطبيعية الثابتة من نموذج الفأر

ابدأ بحقن جليكوليبيد اصطناعي داخل الصفاق في الفأر.

تقوم الخلايا العارضة للمستضد ، أو APCs ، باستيعاب الجليكوليبيد وتقديمه عبر جزيء معقد التوافق النسيجي الكبير غير الكلاسيكي CD1d.

تهاجر APCs إلى الطحال وتتفاعل مع الخلايا التائية القاتلة الطبيعية الثابتة أو خلايا iNKT ، مما يؤدي إلى تنشيط خلايا iNKT وتكاثرها.

حصاد الطحال. فصله ميكانيكيا لتوليد معلق أحادي الخلية.

نقل الخلايا إلى أنبوب. أضف وسط تدرج الكثافة وجهاز طرد مركزي لفصل الخلايا الليمفاوية.

اجمع الخلايا الليمفاوية. أضف رباعيات CD1d المحملة بمستضد الجليكوليبيد والتي تتفاعل مع خلايا iNKT.

قم بإزالة رباعيات غير مرتبطة. تراكب مع الميكروبيدات المغناطيسية التي ترتبط بالفلوروفورات المرتبطة بالرباعي.

قم بإزالة الخرزات غير المقيدة وقم بتحميل تعليق الخلية على عمود مغناطيسي.

تحت المجال المغناطيسي ، يتم الاحتفاظ بخلايا iNKT المرتبطة بالخرزة في العمود بينما تتدفق الخلايا المتبقية من خلاله.

قم بإزالة العمود من المجال المغناطيسي. أضف مخزن مؤقت للشطف لمسح خلايا iNKT.

حقن فأر DBA / 1 العادي داخل الصفاق مع ألفا GalCer ، بجرعة 0.1 ملليغرام لكل كيلوغرام من وزن الجسم. بعد ثلاثة أيام من النمذجة ، بعد التخدير ، عزل طحال الفأر. قم بإعداد تعليق أحادي الخلية عن طريق قطع الطحال وطحنه في منخل 200 شبكة. اغسل تعليق الخلية باستخدام PBS. جهاز طرد مركزي عند 200 مرة جم لمدة 5 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية.

أعد تعليق الخلايا ب 1 مليلتر من محلول تخفيف الدم والأنسجة الكاملة. أضف 3 ملليلتر من وسط فصل الخلايا الليمفاوية للفأر ، ثم قم بالطرد المركزي للخلايا لمدة 20 دقيقة ، عند 300 مرة جم ، في درجة حرارة الغرفة.

لتنقية خلايا iNKT ، أعد تعليق 10 إلى 7 خلايا ب 100 ميكرولتر من 4 درجات مئوية PBS. أضف 10 ميكرولترات من CD1d Tetramer-PE المحمل ب alpha-GalCer واحتضنها عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة في الظلام. اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS ، وأعد تعليقها في 80 ميكرولتر من PBS. أضف 20 ميكرولترا من الميكروبيدات المضادة ل PE واحتضانها عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة في الظلام. اغسلها مرتين باستخدام PBS وأعد تعليق الخلايا ب 500 ميكرولتر من PBS.

ضع عمود الفرز في المجال المغناطيسي لفارز MACS ، واشطفه ب 500 ميكرولتر من PBS. أضف تعليق الخلية المحضر إلى عمود الفرز ، واجمع التدفق ، واشطفه ثلاث مرات باستخدام المخزن المؤقت PBS. قم بإزالة المجال المغناطيسي وأضف 1 مليلتر من المخزن المؤقت PBS إلى عمود الفرز. ادفع المكبس بسرعة بضغط ثابت لدفع الخلايا المسماة إلى أنبوب التجميع ، والحصول على خلايا iNKT المنقاة. عد باستخدام عداد خلوي آلي.