موسوعة JoVE للتجارب
علم المناعة
0 مشاهدة • 4:21 دقيقة • July 8th, 2025
خذ الخلايا القاتلة الطبيعية ، أو NK. أضف ناقلات الفيروسات العدسية التي تشتمل على إنزيمات فيروسية وجزيئات الحمض النووي الريبي الهندسية التي تشفر بروتين الفلورسنت.
أضف البوليمرات الموجبة وترسيب الخلايا والفيروسات.
تعملالبوليمرات على تحييد الشحنات السالبة على كل من الفيروس والخلية ، مما يسهل اندماج الغشاء.
يتم نسخ الحمض النووي الريبي بشكل عكسي إلى الحمض النووي ودمجه في جينوم المضيف ، مما يتيح التعبير عن البروتين الفلوري.
أضف وسائط مكملة بالسيتوكين إنترلوكين -2 ، أو IL-2.
يؤديIL-2 إلى تشغيل الإشارات داخل الخلايا التي تعزز بقاء الخلايا القاتلة الطبيعية وتكاثرها مع الحفاظ على التعبير الجيني المعدل وراثيا.
انقل الخليط إلى مغطى جيدا بالأجسام المضادة التي ترتبط بمستقبلات مناعية معينة على الخلايا القاتلة الطبيعية ، مما يؤدي إلى إطلاق السيتوكينات المضادة للفيروسات.
حدد كمية السيتوكينات المنبعثة لتقييم تأثير البوليمر على إنتاج السيتوكين.
أضف أصباغ الفلورسنت لتسمية الحمض النووي للخلايا النخرية.
باستخدام قياس التدفق الخلوي ، حدد الخلايا الحية وحدد إشارة البروتين الفلوري لقياس كفاءة التنبيغ الناجم عن البوليمر.
قم بتعليق الخلايا المزروعة أو الخلايا الطبيعية الأولية البشرية في آبار صفيحة مكونة من 24 بئرا عند 0.5 × 105 لكل مليلتر من الوسط مع طاف فيروس العدسات GFP في MOY من 5 و 10 و 20 وفي وجود البوليبرين أو كبريتات البروتامين أو ديكستران.
الطرد المركزي الألواح عند 1,000 مرة غرام لمدة 60 دقيقة. بعد ذلك ، دون صب المادة الطافية ، قم بزراعة الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية مملوءة ب 5.2٪ ثاني أكسيد الكربون بين عشية وضحاها. بعد غسل الخلايا ب 10 ملليلتر من PBS ، استخدم 2 ملليلتر من وسط RPMI 1640 مع IL-2 لإعادة تعليق الخلايا.
في اليوم السابق لحصاد الخلايا ، قم بتغطية 96 بئرا من ألواح البوليسترين عالية الامتصاص للبروتين ب 2.5 ميكروغرام لكل ملليلتر من الأجسام المضادة أحادية النسيلة المضادة ل NKG2D ، واحتضان الألواح في درجة حرارة الغرفة أو في الثلاجة طوال الليل. في اليوم التالي ، استخدم 100 ميكرولتر من PBS لغسل كل بئر ثلاث مرات.
احصد الخلايا القاتلة الطبيعية المنقولة عن طريق النقر برفق أولا على الألواح. ثم أضف 100 ميكرولتر من الخلايا إلى كل بئر من الألواح المكونة من 96 بئرا. بعد 16 إلى 18 ساعة من التنشيط، استخدم ماصة متعددة القنوات لتجميع المواد الطافية. بعد ذلك ، باستخدام السيتوكينات المؤتلفة من مجموعة ELISA ، قم بإنشاء منحنى قياسي وتحديد كمية السيتوكينات مثل الإنترفيرون جاما في المادة الطافية.
لاختبار صلاحية الخلايا القاتلة الطبيعية ، بعد أربعة أيام من التنبيغ ، اغسل الخلايا ب 10 ملليلتر من PBS البارد مرتين. بعد ذلك ، قم بحصاد الخلايا واستخدم ملحق-V / 7-أمينو-أكتينومايسين D لتلطيخها. استخدم قياس التدفق الخلوي لتحديد النسبة المئوية للخلايا النخرية بين الخلايا القاتلة الطبيعية المحولة ، وتحليل البيانات وفقا لبروتوكول النص.