موسوعة JoVE للتجارب
علم المناعة
0 مشاهدة • 2:57 دقيقة • July 8th, 2025
ابدأ بأنبوب يحتوي على mRNAs المنسوخة في المختبر والتي تشفر بروتينات الفلورسنت الخضراء.
يحتوي الرنا المرسال على نيوكليوتيدات معدلة ، 5-ميثيل سيتيدين ثلاثي فوسفات ، وثلاثي فوسفات سودودوريدين ، مما يمنع الاستجابة المناعية ويعزز استقرار الرنا المرسال المرسال.
يتم إزالة الفسفرة من نهاية 5 'من mRNA ، مما يمنع التعرف عليها بواسطة مستقبلات التعرف على الأنماط على الضامة.
أضف كاشف تعداء قائم على الدهون الموجبة إلى mRNA ، مما يسهل تغليف mRNA من خلال التفاعلات الكهروستاتيكية وتشكيل معقد.
أدخل مجمعات الدهون والحمض النووي الريبي المرسال في صفيحة متعددة الآبار مع البلاعم الأولية المشتقة من الفأر الملتصقة وحركها برفق للخلط المنتظم.
تستوعب البلاعم المركب المحتوي على الرنا المرسال في جسيم داخلي. في وقت لاحق ، يندمج المركب مع الغشاء الداخلي ، ويطلق mRNAs في سيتوبلازم الخلية.
يعملذيل poly-A في الطرف 3 على استقرار mRNA الذي يخضع لتخليق البروتين لإنتاج بروتينات الفلورسنت الخضراء.
تحت المجهر الفلوري ، يشير التألق الأخضر داخل البلاعم إلى التعدي الناجح باستخدام mRNAs المعدلة.
استعد للتعداء عن طريق إضافة الحجم المحسوب مسبقا للمخزن المؤقت لتعداء الرنا المرسال مطروحا منه أحجام كاشف تعداء الرنا المرسال والحمض النووي الريبي المرسال إلى أنبوب التفاعل. قم بإذابة مخزون mRNA واخلطه برفق عن طريق قلب الأنبوب. ثم أضف الحجم المحسوب مسبقا للرنا المرسال إلى أنبوب التفاعل.
قمبتدوير مزيج التفاعل وكاشف تعداء mRNA ، ثم أضف الحجم المناسب لكاشف تعداء mRNA إلى أنبوب مزيج التفاعل. قم بتدوير الأنبوب ، ثم احتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. وفي الوقت نفسه ، استبدل وسط استزراع البلاعم بوسط ثقافة طازج ودافئ.
بمجرد اكتمال حضانة مزيج التعدي ، أضف المزيج إلى آبار الصفيحة التي تحتوي على البلاعم بالتنقيط وفي دائرة من الخارج إلى منتصف البئر. لضمان التوزيع المنتظم لمزيج التعداء ، قم بهز اللوحة برفق في اتجاه رأسي وأفقي.
ثم احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ست ساعات على الأقل. بعد الحضانة ، قم بتحليل كفاءة التعدي باستخدام المجهر الفلوري أو قياس التدفق الخلوي أو اللطخة المناعية.
يتمثلالجزء الأكثر أهمية في هذا الإجراء في ضمان التوزيع المنتظم لمزيج التعدي بحيث تتلامس جميع البلاعم مع نفس الكمية من mRNA.