موسوعة JoVE للتجارب
علم المناعة
0 مشاهدة • 5:23 دقيقة • July 8th, 2025
ابدأ بخلايا دم الحبل السري البشري ، بما في ذلك الخلايا الجذعية المكونة للدم CD34 + ، أو الخلايا الجذعية المكونة للدم.
أضف أجساما مضادة لمنع مستقبلات Fc الخلوية ، مما يمنع الارتباط غير المحدد للحبات المغناطيسية الخاصة ب HSC.
أدخل الخرز المغناطيسي المطلي بالأجسام المضادة الذي يستهدف CD34 + HSCs. جهاز طرد مركزي وتخلص من المادة الطافية.
قم بإعادة تعليق الخلايا في مخزن مؤقت. قم بتمريرها عبر فاصل مغناطيسي للاحتفاظ ب HSCs المرتبطة بالخرز. تتدفق الخلايا غير المنضمة من خلال.
قم بإزالة المجال المغناطيسي لتجميع HSCs.
جهاز الطرد المركزي وإعادة تعليق الخلايا في وسط النمو. لوحة الخلايا واحتضنها.
يحتوي الوسط على عوامل النمو والسيتوكينات التي تعزز بقاء HSC وتوسعه.
حصاد الخلايا. أضف وسط تجميد ، وانقله إلى التبريد ، ثم قم بتجميده.
لتوليد جهاز مناعة بشري ، أو IS ، نموذج الفأر ، قم بإذابة الخلايا الحساسة الحساسة. أضفها إلى وسط دافئ مسبقا.
جهاز الطرد المركزي وإعادة تعليق الخلايا في مخزن مؤقت.
الخلايا جاهزة للحقن في جرو فأر يعاني من نقص المناعة لجيل نموذج HIS
للبدء ، قم بإعادة تعليق حبيبات الخلية الإيجابية CD34 المعزولة من دم الحبل السري في 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت لفاصل الخلايا المغناطيسية لكل 1 × 108 خلايا. أضف 100 ميكرولتر من كاشف حجب FcR لكل 1 × 108 خلايا ، متبوعا ب 100 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي الموجب CD34 لكل 1 × 108 خلايا ، واحتضانه عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.
بعد ذلك ، أضف 5 ملليلتر من المخزن المؤقت لفاصل الخلايا المغناطيسية لكل 1 × 108 خلايا وتدور عند 360 جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. كرر خطوة الغسيل وأعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر لكل 100 مليون خلية من المخزن المؤقت لفاصل الخلايا المغناطيسية في أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر يسمى "غير مجزأ". قم بتسمية أنبوبين آخرين سعة 15 مليلتر - سلبي CD34 وإيجابي CD34. ضع الأنابيب الثلاثة على رف التبريد.
افصل الخلايا باستخدام برنامج الاختيار الإيجابي المكون من عمودين على فاصل الخلايا المغناطيسية الأوتوماتيكي في خزانة السلامة الحيوية. بعد ذلك ، لتوسيع وتجميد الخلايا الجذعية البشرية الإيجابية CD34 ، قم بإعداد دم الحبل السري أو وسط CB كما هو موضح في المخطوطة وقم بالمرور عبر مرشح 0.22 ميكرون. قم بتعليق الخلايا الإيجابية CD34 عند 100,000 لكل مليلتر من وسط CB ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية.
في اليوم الثالث ، أضف حجما متساويا من وسط CB بدون السيتوكينات إلى القارورة. في اليوم الخامس ، حصاد الخلايا الموسعة الإيجابية CD34. ماصة تعليق الخلية لأعلى ولأسفل وتجميعها في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. أضف ما يكفي من وسط CB لتغطية قاع القارورة. باستخدام مكشطة الخلية ، اكشط الجزء السفلي من القارورة بالكامل. اجمع كل الوسائط في نفس الأنبوب سعة 50 مليلتر وجهاز الطرد المركزي.
أعد تعليق الخلايا في 2 مل من وسط CB ، وأجهزة الطرد المركزي. استنشق الوسط إلى الحبيبات, وأعد تعليق الحبيبات في وسط تجميد. بعد ذلك ، ابدأ في تحضير الخلايا الإيجابية CD34 بعد ثلاث ساعات من تشعيع الجرو. قم بتسخين 10 مل من وسائط CB في أنبوب سعة 50 مل.
استرجع قارورة واحدة من الخلايا الموسعة والمجمدة CD34 في المختبر لكل أربعة إلى ستة صغار لحقنها. قم بإذابة الثلج بسرعة عند 50 إلى 55 درجة مئوية ، حتى تظهر كمية صغيرة من الجليد ، وأضف الخلايا إلى وسط CB الدافئ. استخدم 1 مليلتر من الوسط لشطف كل قارورة وتدوير الخلايا على 360 جم لمدة 12 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
استنشق الوسط بعناية. أعد تعليق الحبيبات في 2 ملليلتر من وسائط CB وعد الخلايا. مرة أخرى ، قم بالطرد المركزي للخلايا ، واستنشاق الوسط ، وأعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من PBS المعقم لكل n بالإضافة إلى 1 جرو للحقن ، مما ينتج عنه 250,000 إلى 450,000 خلية إيجابية CD34 لكل فأر.