موسوعة JoVE للتجارب
علم المناعة
0 مشاهدة • 3:44 دقيقة • July 8th, 2025
خذ قطعتين من الكوفيت بالتثقيب الكهربائي. يحتوي أحد الكوفيت على RNA صغير متداخل ، أو siRNA ، مصمم لتثبيط إنتاج FIP200 ، وهو بروتين محفز للالتهام الذاتي.
يحتويالكوفيت الثاني على siRNA مخفوق كعنصر تحكم لا يمنع إنتاج FIP200.
أضف الخلايا المتغصنة غير الناضجة ، أو iDCs ؛ المثق الكهربائي للدخول الخلوي ل siRNA ثم صفيحة الخلايا.
يرتبط siRNA الداخلي بمركب إسكات يحفز الحمض النووي الريبي.
يشق المركب الذي يحتوي على siRNA الخاص ب FIP200 mRNA المستهدف ، مما يثبط إنتاج FIP200 ، بينما تنتج iDCs المعالجة ب siRNA FIP200.
احصد الخلايا وأضف فيروس الهربس البسيط. عند اندماج غشاء الخلية المغلفة الفيروسية ، يدخل الحمض النووي المنبعث إلى النواة ويؤدي إلى إنتاج البروتينات الفيروسية والنوكليوكابسيدات.
البروتينات الفيروسية تعطل اللامين النووي. يشكل FIP200 مركبا يؤدي إلى سلسلة إشارات ، مما يؤدي إلى الالتهام الذاتي لللامين المعطل لاستهدافها من أجل التحلل وتسهيل هروب النيوكليوكابسيدات الفيروسية إلى السيتوبلازم.
يقيد تثبيط إنتاج FIP200 بوساطة siRNA الالتهام الذاتي اللامين ، مما يمنع هروب نوكليوكابسيد.
الخلايا جاهزة لتقييم تثبيط الالتهام الذاتي الناجم عن siRNA.
في اليوم 3.5 بعد الالتصاق ، قم بنقل 12 مليون iDCs إلى أنبوب سعة 50 ملليلترا. قم بالطرد المركزي بمعدل 300 مرة جم لمدة 5 دقائق ، ثم تخلص من المادة الطافية. في موازاة ذلك ، قم بإجراء تحليل التدفق الخلوي لمراقبة حالة النضج.
اغسل وحدات التحكم الكهربائي (iDCs) برفق في 5 مل من OptiMEM بدون أحمر الفينول ، وقم بطردها بحرارة 300 مرة جم لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من OptiMEM ، مع ضبط تركيز الخلية إلى 6 ملايين خلية لكل 100 ميكرولتر.
أضف 75 بيكامول من siRNA الخاص ب FIP200 أو المخفوق إلى كوفيتات قطب كهربائي مقاس 4 ملم وانقل 100 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى الكوفيت المعني. نبض الترابط الكهربائي مباشرة باستخدام جهاز التثقيب الكهربائي.
بعد التثقيب الكهربائي ، انقل iDCs إلى ستة ألواح ذات ستة آبار مع وسط DC طازج دافئ مسبقا ، وزرع الخلايا بتركيز نهائي قدره 1 مليون خلية لكل مليلتر ، ووضعها في الحاضنة. بعد 48 ساعة ، افحص مورفولوجيا iDCs المجهرية ، ثم قم بحصاد الخلايا باستخدام مكشطة خلية ، وانقلها إلى أنابيب سعة 15 ملليلترا.
شطف الآبار مع 1 ملليلتر من PBS مكمل مع 0.01٪ EDTA ونقل المحلول إلى الأنابيب المعنية. بعد ذلك ، قم بتقسيم الخلايا لكل حالة siRNA كما هو موضح في المخطوطة.
استخدم 500,000 خلية لتقييم حالة النضج وصلاحية الخلية. استخدم 1 مليون خلية لتحليل اللطخة الغربية للتحقق من 200 كفاءة ضربة قاضية محددة ، واستخدم الخلايا المتبقية لتجارب عدوى فيروس الهربس البسيط -1.