JoVE Encyclopedia of Experiments
علم المناعة
0 مشاهدات • 4:42 د • July 8th, 2025
خذ نواقل الفيروسات القهقرية الممزوجة بخلايا الطحال الأولية.
تحتوي النواقل على الحمض النووي الريبي المعدل وراثيا الذي يشفر مستقبلات مستضد خيميرية أو CAR ، والذي يستهدف مستضد خاص بالورم.
يعززالسيتوكين إنترلوكين -2 في الوسائط بشكل انتقائي تكاثر الخلايا التائية بينما تموت الخلايا الأخرى في النهاية.
انقل الخليط إلى صفيحة دقيقة مغطاة بشظايا فيبرونيكتين المؤتلفة.
جهاز طرد مركزي لتسهيل شظايا الفبرونيكتين التي تربط النواقل والخلايا التائية ، وتتوسط في تفاعل الخلايا المضيفة للفيروس ، وتحتضن.
عند اندماج غلاف النواقل مع غشاء الخلية ، تقوم الإنزيمات الفيروسية بنسخ الحمض النووي الريبي المنبعث في الحمض النووي ودمجه في جينوم المضيف.
تعبر الخلايا التائية المنقولة عن CARs المرتبطة بالسطح ، والتي تتكون من جزء متغير من الجسم المضاد خارج الخلية يستهدف المستضد الخاص بالورم ومناطق الإشارات داخل الخلايا للاستجابة للمستضد.
أعد تعليق الخلايا قبل نقلها إلى أنبوب.
جهاز الطرد المركزي للتخلص من المادة الطافية التي تحتوي على فيروسات غير داخلية ، وإعادة تعليق الخلايا في مخزن مؤقت للمقايسات النهائية.
في اليوم التالي لاستئصال الطحال ، قم بإعداد PBS يحتوي على 25 ميكروغرام لكل مليلتر من جزء فيبرونكتين بشري مؤتلف أو RHFF وقم بتغطية ألواح 24 بئرا غير المعالجة بزراعة الأنسجة عن طريق إضافة 0.5 مل من المحلول إلى كل بئر. في اليوم التالي ، قم بإزالة المحلول من الآبار ، وأضف 1 مليلتر لكل بئر بنسبة 2٪ BSA في PBS.
احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة ، ثم قم بإزالة BSA عن طريق قلب اللوحة بإحكام قبل إضافة 2 مل من PBS لغسلها. بعد جمع المادة الطافية الفيروسية من الخلايا HEK293T ، أضف الطب الصيني التقليدي الطازج إلى الحجم النهائي بالملليلتر يساوي عدد الآبار المطلية ب RHFF بالإضافة إلى 3 ملليلتر إضافية.
قم بإزالة خلايا الطحال المستنبتة من الحاضنة ، وأعد تعليقها عن طريق سحب العينة برفق لأعلى ولأسفل مرتين إلى ثلاث مرات في كل بئر. انقل معلقات الخلية إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل. بعد ذلك ، أعد تعليق خلايا الطحال في الطاف الفيروسي إلى 1 × 106 خلايا لكل مليلتر.
ثم أضف 1 مليلتر لكل بئر من تعليق خلايا الطحال إلى آبار الألواح المطلية ب RHFF. الآن ، قم بتدوير الصفائح لمدة 90 دقيقة عند 32 درجة مئوية و 770 جمثانية مع تسارع 4 وإعداد كسر صفر. أثناء الدوران ، قم بإعداد 50 وحدة دولية لكل مليلتر من IL-2 البشري المؤتلف في الطب الصيني التقليدي.
بعد الدوران ، أضف 1 مليلتر من الوسط إلى كل بئر من الألواح واحتضنه طوال الليل. إذا وصلت الخلايا التائية إلى أكثر من 80٪ من التقاء ، فقم بتقسيم الخلايا عن طريق سحب العينات برفق لأعلى ولأسفل في كل بئر ، مرتين إلى ثلاث مرات ، ثم انقل 1 مليلتر من كل بئر إلى آبار جديدة من صفيحة جديدة معالجة بزراعة الأنسجة المكونة من 24 بئرا.
أضف 1 مليلتر من الطب الصيني التقليدي الطازج ، مع 50 وحدة دولية لكل مليلتر من IL-2 لكل بئر. إذا لم تصل الخلايا إلى أكثر من 80٪ من التقاء ، فقم بتغيير نصف الوسط عن طريق سحب 1 مليلتر من الوسط ببطء من أعلى كل بئر واستبداله ب 1 مليلتر من الطب الصيني التقليدي الطازج ، الذي يحتوي على 50 وحدة دولية لكل مليلتر من IL-2 البشري المؤتلف.
قم بتعليق الخلايا التائية CAR عن طريق سحب العينات برفق لأعلى ولأسفل ثلاث مرات في كل بئر، ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي سعة 250 ملليلترا. قم بتدوير الخلايا بوزن 300 جمثانية لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، قم بشفط المادة الطافية تماما دون إزعاج الحبيبات. استخدم PBS لغسل الخلايا ، ثم عدها قبل غسلها مرة ثانية. يبلغ إنتاجية الخلايا التائية CAR النموذجية حوالي 1 × 106 خلايا لكل بئر.