JoVE Encyclopedia of Experiments
علم المناعة
0 مشاهدات • 2:30 د • July 8th, 2025
خذ الخلايا التائية المعلقة في وسط مناسب للتثقيب الكهربائي ، وهي عملية تخلق فيها النبضات الكهربائية مساما مؤقتة في غشاء الخلية.
أضف مجمعات تحتوي على بروتين Cas9 ودليل واحد RNA أو sgRNA. sgRNA هو RNA صغير يوجه Cas9 ، وهو مقص جزيئي ، إلى موقع محدد على الحمض النووي للقطع.
أضف جزيئات الحمض النووي القصيرة أحادية الشريطة التي تساعد في نقل مجمعات Cas9-sgRNA إلى الخلية.
انقل هذا الخليط إلى كوفيت وابدأ التثقيب الكهربائي عن طريق تطبيق نبضات كهربائية قصيرة.
تسمح هذه العملية للمجمعات بدخول الخلية.
يرتبط sgRNA بالموقع المستهدف في الحمض النووي للخلية التائية ، مما يسمح ل Cas9 بتحرير الحمض النووي ، مما يؤدي إلى حدوث انقطاع في كلا الخيطين
يشير هذا الاضطراب إلى بروتينات الإصلاح إلى الموقع.
ثم تعيد بروتينات الإصلاح توصيل الأطراف ، مما يجعل الجين غير وظيفي.
احتضان الخلايا التائية المعدلة جينيا في وسط مناسب للمقايسات النهائية.
قم بإعداد البروتين النووي الريبي ، أو مركب RNP ، عن طريق احتضان 10 ميكروغرام من نوكلياز Cas9 مع 5 ميكروغرامات من الحمض النووي الريبي الإرشادي الفردي لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بتضمين تحكم وهمي بدون RNA موجه واحد. اجمع بين الخلايا التائية المعلقة ومركب RNP وأضف 4.2 ميكرولتر من محسن التثقيب الكهربائي 4 ميكرومولار. تخلط جيدا وتنقل إلى كوفيت التثقيب الكهربائي.
قم بطلاء الخلايا بالكهرباء باستخدام رمز النبض EH-1-11. بعد ذلك ، احتضان 5 ملايين خلية لكل مليلتر في R-10 ، مكملة بخمسة نانوغرام لكل مليلتر من IL-7 البشري و Il-15 البشري عند 30 درجة مئوية لمدة 48 ساعة في ألواح من 12 بئرا. بعد الحضانة ، تابع تنشيط الخلايا التائية وتوسعها.