توليد لقاح حويصلة غشاء خارجي متعدد التكافؤ

خذ كعدد الإرسال الذي يحتوي على بلازميدات مستهدفة مرتبطة بالبوليمر. تقوم البلازميدات بتشفير مستضد فيروسي مدمج في علامة الببتيد وعلامة التقارب.

احتضان الممرات بخلايا الثدييات ، والتي تستوعب البوليبلكس داخل الجسيمات الداخلية.

يحفز البوليمر تمزق الحويصلة. تعبر البلازميدات المنبعثة عن المستضد الفيروسي الذي يفرز خارج الخلية.

حصاد المادة الطافية التي تحتوي على المستضد والملوثات. أضف عاملا منافسا بتركيز منخفض.

قم بتحميله على عمود كروماتوغرافيا التقارب.

ترتبط علامات التقارب براتنج العمود ، مما يؤدي إلى شل حركة المستضد ، بينما يقلل العامل المنافس من الارتباط غير المحدد.

قم بتدفق العامل المنافس بتركيز منخفض ، وإزالة الملوثات ذات الارتباط الضعيف.

اغسل بتركيزات متزايدة من العوامل المتنافسة لإزاحة المستضدات المرتبطة بقوة ، وتفويضها.

أدخل حويصلات الغشاء الخارجي البكتيرية ، أو OMVs ، مع بروتين التقاط مرتبط بالسطح واحتضانه.

ترتبط علامات ببتيد المستضد ببروتينات الالتقاط ، وتشكل لقاح OMV مع عرض مستضد متعدد التكافؤ.

قم بإجراء تنقية OMV SpyCatcher. ابدأ بالطرد المركزي للمحلول البكتيري. قم بتصفية المادة الطافية باستخدام مرشح غشائي 0.22 ميكرومتر ، ثم ركزها باستخدام عمود ألياف مجوف. قم بتصفية المركز من خلال مرشح غشائي 0.22 ميكرومتر ، ثم قم بالطرد المركزي عند 150,000 مرة جم عند 4 درجات مئوية لمدة ساعتين باستخدام جهاز طرد مركزي فائق ، وتخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة. أعد تعليق هطول الأمطار باستخدام PBS وقم بتخزينه عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.

لإجراء تعداء RBD-SpyTag ، ابدأ باختيار نظام تعبير حقيقيات النواة مناسب ، وقم بزراعة الخلايا طوال الليل بمعدل 130 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية بعد التعافي. أضف 20 ميكرولترا HEK293F من محلول الخلية إلى عداد الخلية الآلي. سجل عدد الخلايا. اضبط التركيز على 1 في 10 إلى الخلايا السادسة لكل مليلتر ، ثم قم بزراعة الخلايا بمعدل 130 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات.

قم بتصفية بلازميد RBD-SpyTag من خلال مرشح غشائي 0.22 ميكرومتر وأضف 300 ميكروغرام من البلازميدات إلى وسط زراعة الخلية حتى يصبح الحجم النهائي 10 ملليلتر. رج العبوة لمدة 10 ثوان. تسخين PEI إلى 65 درجة مئوية في الحمام المائي. امزج 0.7 مل من PEI مع 9.3 مل من وسط زراعة الخلايا ورجه بشكل متقطع لمدة 10 ثوان.

أضف محلول البلازميد إلى محلول PEI. رجي الخليط بشكل متقطع لمدة 10 ثوان واحتضنه على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. يضاف الخليط إلى 280 مل من وسط زراعة الخلايا ويزرعه بمعدل 130 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية لمدة 5 أيام.

بعد ذلك ، قم بإجراء تنقية RBD-SpyTag. ابدأ بالطرد المركزي للخلايا عند 6,000 مرة جم عند 25 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. واستخدم ماصة لجمع المادة الطافية. قم ببناء العمود ب 2 مل من النيكل NTA agarose واغسله ثلاث مرات باستخدام PBS.

أضف إيميدازول إلى المادة الطافية للخلية لجعل التركيز النهائي 20 ملليمولار وتحميل المادة الطافية للخلية. أضف 3 أحجام أعمدة من PBS تحتوي على 20 مليمولار من إيميدازول للغسيل وجمع جزء الغسيل. تدرج متدرج مع ثلاثة أحجام أعمدة من PBS تحتوي على تركيزات منخفضة إلى عالية من إيميدازول. قم بإزالته مرتين لكل تركيز.

لتحديد تركيز البروتين بطريقة BCA ، قم بتخفيف محلول بروتين BSA القياسي بشكل متسلسل من 2 إلى 0.0625 ملليغرام لكل ملليلتر. قم بتخفيف OMV SpyCatcher و RBD-SpyTag المنقى 10 مرات. ثم امزج محليل العمل BCA A و B بنسبة 50 إلى 1. أضف محلول البروتين المخفف واخلطه مع محلول عمل BCA. احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. قم بقياس الامتصاص عند 562 نانومتر من كل بئر ، واحسب تركيز البروتين من المنحنى القياسي.

لإجراء الاقتران الحيوي ل OMV SpyCatcher و RBD-SpyTag ، امزج OMV SpyCatcher في RBD-SpyTag في PBS بنسبة 40 إلى 1. قم بالتدوير عموديا لخلط الخليط طوال الليل بمعدل 15 دورة في الدقيقة عند 4 درجات مئوية. قم بتنقية OMV RBD باستخدام محلول PBS باستخدام إجراء مشابه لتنقية OMV SpyCatcher.