موسوعة JoVE للتجارب
علم المناعة
0 مشاهدة • 4:22 دقيقة • July 8th, 2025
خذ مزيجا من CRISPR RNA ، أو crRNA ، و crRNA المنشط عبر التنشيط أو tracrRNA.
سخني الخليط واتركيه ليبرد ، مما يسهل الاقتران الأساسي ل tracrRNA مع crRNA لتشكيل دليل RNA ، أو gRNA.
أضف مقصا جزيئيا يسمى إنزيمات Cas9 التي ترتبط ب gRNA ، مما يؤدي إلى تكوين مجمعات.
أضف مجمعات Cas9-gRNA إلى خلايا Natural Killer أو NK المعلقة في محلول التثقيب الكهربائي.
إدخال جزيئات الحمض النووي أحادية الشريطة التي تساعد في نقل مجمعات Cas9-gRNA.
انقل الخليط إلى كوفيت وقم بإجراء التثقيب الكهربائي ، مما يخلق مساما مؤقتة في الغشاء لدخول المجمعات إلى الخلية.
يرتبط الحمض النووي الريبي المرسال بالموقع المستهدف في الجينوم ، مما يسمح ل Cas9 بشق الحمض النووي.
ترتبط بروتينات الإصلاح في موقع الكسر وتنضم إلى الحمض النووي ، وغالبا ما تتسبب في حدوث أخطاء في إدخال زوج القاعدة أو حذفها. يؤدي التعديل الناتج إلى تعطيل الجين المستهدف ، مما يجعله غير وظيفي.
نقل الخلايا المعدلة وراثيا إلى وسط مناسب لمزيد من التحليل.
في يوم التثقيب الكهربائي ، املأ قارورة T25 واحدة ب 8 مل من وسط الاستزراع الطازج مع 100 وحدة دولية لكل مليلتر من IL-2 لكل حالة خلية تجريبية ، وضع القوارير في حاضنة رطبة 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
أثناء توازن الوسط ، أضف 3 إلى 4 × 106 خلايا لكل حالة ، لكل 26 ميكرولتر من مزيج التنبيغ في أنبوب مخروطي الشكل ،
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية