JoVE Encyclopedia of Experiments
علم المناعة
0 مشاهدات • 4:22 د • July 8th, 2025
خذ مزيجا من CRISPR RNA ، أو crRNA ، و crRNA المنشط عبر التنشيط أو tracrRNA.
سخني الخليط واتركيه ليبرد ، مما يسهل الاقتران الأساسي ل tracrRNA مع crRNA لتشكيل دليل RNA ، أو gRNA.
أضف مقصا جزيئيا يسمى إنزيمات Cas9 التي ترتبط ب gRNA ، مما يؤدي إلى تكوين مجمعات.
أضف مجمعات Cas9-gRNA إلى خلايا Natural Killer أو NK المعلقة في محلول التثقيب الكهربائي.
إدخال جزيئات الحمض النووي أحادية الشريطة التي تساعد في نقل مجمعات Cas9-gRNA.
انقل الخليط إلى كوفيت وقم بإجراء التثقيب الكهربائي ، مما يخلق مساما مؤقتة في الغشاء لدخول المجمعات إلى الخلية.
يرتبط الحمض النووي الريبي المرسال بالموقع المستهدف في الجينوم ، مما يسمح ل Cas9 بشق الحمض النووي.
ترتبط بروتينات الإصلاح في موقع الكسر وتنضم إلى الحمض النووي ، وغالبا ما تتسبب في حدوث أخطاء في إدخال زوج القاعدة أو حذفها. يؤدي التعديل الناتج إلى تعطيل الجين المستهدف ، مما يجعله غير وظيفي.
نقل الخلايا المعدلة وراثيا إلى وسط مناسب لمزيد من التحليل.
في يوم التثقيب الكهربائي ، املأ قارورة T25 واحدة ب 8 مل من وسط الاستزراع الطازج مع 100 وحدة دولية لكل مليلتر من IL-2 لكل حالة خلية تجريبية ، وضع القوارير في حاضنة رطبة 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
أثناء توازن الوسط ، أضف 3 إلى 4 × 106 خلايا لكل حالة ، لكل 26 ميكرولتر من مزيج التنبيغ في أنبوب مخروطي الشكل ، وقم بتكسير الخلايا عن طريق الطرد المركزي. بعد ذلك ، اغسل الخلايا ثلاث مرات في 12 مل من PBS المعقم لكل غسلة لإزالة كل FBS من معلقات الخلية.
أثناء غسل الخلايا ، أعد تعليق كل CRISPR RNA و RNA للتتبع إلى 200 تركيز نهائي من الميكرومولار. امزج 2.2 ميكرولتر من كل كرسبر RNA مع حجم واحد 200 ميكرومولار من الحمض النووي الريبي التتبع لكل عينة وقم بتسخين العينات عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. بعد ذلك ، اترك العينات لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة ، وقم بتخزين مجمعات الحمض النووي الريبي CRISPR RNA - التتبع عند سالب 20 درجة مئوية حتى استخدامها.
لتشكيل مجمعات البروتين النووي الريبي ، أضف نوكلياز Cas9 إلى مركب CRISPR RNA - tracer RNA المناسب مع الدوران لأكثر من 30 إلى 60 ثانية ، واحتضان مجمعات البروتين النووي الريبي Cas9 الناتجة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 إلى 20 دقيقة.
بعد الغسيل الأخير ، أضف الحجم الكامل لمكملات التثقيب الكهربائي من مجموعة محلول Nucleofector P3 وأعد تعليق كل حبيبات خلية في 20 ميكرولترا من محلول P3 الأساسي 4D-Nucleofector ، مع الحرص على تجنب فقاعات الهواء.
أضف على الفور 5 ميكرولترات من كل مركب بروتين نووي ريبي إلى تعليق الخلية المناسب ، وأضف 1 ميكرولتر من 100 ميكرومولار محسن التثقيب الكهربائي Cas9 إلى مزيج الخلايا المعقدة للبروتين النووي الريبي Cas9. انقل 26 ميكرولترا من محلول خلية البروتين النووي الريبي Cas9 إلى آبار فردية لشريط Nucleocuvette ، واضغط برفق على الشريط للتأكد من أن العينات تغطي قاع كل بئر.
ثم ابدأ برنامج نظام 4D-Nucleofector EN-138. في نهاية التنبيغ ، اترك الخلايا ترتاح لمدة ثلاث دقائق. بعد ذلك ، أضف 80 ميكرولترا من وسط الاستزراع المتوازن مسبقا إلى كل كوفيت ، وانقل العينات برفق إلى قارورة واحدة لكل حالة عند 37 درجة مئوية حضانة.