توليد فيروسات الأنفلونزا الحية المؤتلفة الموهنة للقاحات

ابدأ بالبلازميدات ثنائية الاتجاه التي تحمل (كدنا) التي تشفر بعض البروتينات الأساسية الفيروسية لسلالة الأنفلونزا المتكيفة مع البرد.

إدخال مجموعة جديدة من البلازميدات ثنائية الاتجاه التي تحتوي على الهيماجلوتينين و(كدنا) النورامينيداز المعدل من سلالة مختلفة من الإنفلونزا.

أدخل كاشف تعداء إلى هذا المزيج واحتضانه لتشكيل مركب مع البلازميدات.

انقل هذه المجمعات إلى خلايا شبيهة بالظهارة البشرية المزروعة لتمكين دخول البلازميد إلى الخلية.

تتيح

البلازميدات ثنائية الاتجاه مع اثنين من المحفزين في اتجاهين متعاكسين إنتاج البروتينات الفيروسية والحمض النووي الريبي المقابل لها.

احتضان الخلايا عند درجة حرارة منخفضة.

تتجمع البروتينات الفيروسية والحمض النووي الريبي الفيروسي ذاتيا لتشكيل فيروسات إنفلونزا مؤتلفة متكيفة مع البرد مع انخفاض التكاثر في الظروف الأكثر دفئا.

تراكب مع خلايا MDCK التي تفرط في حمض السياليك وإنزيمات التربسين المعدلة التي تسمح بالارتباط الفيروسي والدخول داخل الخلايا.

احتضان في نفس درجة الحرارة للحث على تكاثر وإنتاج فيروسات جديدة.

جهاز الطرد المركزي وحصاد فيروسات الأنفلونزا الحية الموهنة المؤتلفة الجاهزة لإعداد اللقاح.

للبدء ، ضع مليون خلية 293T في كل بئر من صفيحة مكونة من 6 آبار مع DMEM يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني و 1٪ بكتيريا القلم. بعد ذلك ، قم بإعداد خليط تعداء البلازميد الكافي ل 100 ميكرولتر لكل بئر. اجمع ميكروغرام من كل بلازميد واملأ الأنبوب بوسط خلية Opti-MEM الدافئ مسبقا إلى 50 ميكرولترا. في أنبوب آخر ، أضف ضعف حجم الليبوفيكتامين 2000 المقابل للكمية الإجمالية من البلازميد المراد نقلها ، وقم بتغطية الأنبوب إلى 50 ميكرولتر باستخدام Opti-MEM.

قبل إضافة مزيج التعداء إلى الخلايا ، اتركه لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم أضف 100 ميكرولتر من مزيج التعداء إلى كل بئر وانقل اللوحة إلى حاضنة لمدة 16 ساعة. في اليوم التالي ، قم بتغيير الوسيط إلى DMEM مع 0.3٪ BSA و 1٪ بكتيريا القلم. ثم. انقل الخلايا إلى 33 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة خمس ساعات.

بعد خمس ساعات، أضف تراكبا من مليون خلية MDCK متساهلة بالإنفلونزا في DMEM المكمل بالتربسين. الحفاظ على المزارع المشتركة لمدة 2 إلى 3 أيام في ظل نظام حضانة 33 درجة مئوية لتوليد الفيروس وتضخيمه. في وقت لاحق ، قم بإزالة الحطام باستخدام دوران مدته خمس دقائق 260 جم ، ثم اجمع المواد الطافية.