Name: الكشف عن تعديلات بسيطة في أوراق النبات (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: اكتشف طريقة كروماتين المناعي الترسيب لتحديد تعديلات الهيستون في جينات النباتات باستخدام Arabidopsis. توفر هذه التقنية رؤى جزيئية حاسمة حول تنظيم التعبير الجيني والاستجابات الفسيولوجية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> وقد تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الألمانية (DFG) ومبادرة التميز للحكومات الفيدرالية وحكومات الولايات الألمانية. </p>

<p class="jove_title" style=";text-align:right;direction:rtl"> 1. يشابك من المواد النباتية </p><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصاد 1 - 2G من أوراق Arabidopsis (6 إلى قطرها 10cm ريدة) في أنبوب بلاستيكي 50 مل وملء ما يصل الى 40mL مع العازلة يشابك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد يترك البقاء مغمورة ، على سبيل المثال عن طريق حشو a مصممة الحق الاسفنج تصفية فوق سطح العازلة. ثم ضع الأنابيب في مجفف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فراغ التسلل ل10min. إضافة إلى كل أنبوب 2.5mL من جليكاين 2M لوقف يشابك ، وعكس أنابيب لتبرير تشتت جليكاين على قدم المساواة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فراغ 5min التسلل لآخر وتجاهل السائل في حين حصد يترك على منخل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل أوراق مرتين مع 1L المياه في كوب من الزجاج ، ثم يترك ليجف تماما مناشف ورقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الأوراق في أنبوب بلاستيكي الطازجة والتجميد في النيتروجين السائل. تخزين الأوراق في عزلة -80 درجة مئوية حتى لونين. </li></ol><p class="jove_title" style=";text-align:right;direction:rtl"> 2. عزلة لونين </p><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كانت الأرض يترك مع مدافع الهاون والمدقة التي تم حفظها في النيتروجين السائل حتى الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل مسحوق لأنبوب بلاستيكي 50 مل وتعليق العازلة في استخراج 30mL # 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لاحتضان 15min في 4 درجات مئوية على شاكر في سماء المنطقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رشاحة تعليق من خلال أربع طبقات من miracloth في أنبوب جديد من البلاستيك 50 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور في ل20min XG 2800 في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة ووقف بيليه طاف مع فرشاة الطلاء العازلة في استخراج 1mL # 2. أول إضافة كمية صغيرة من المخزن رقم 2 ، ثم وقف مع بيليه فرشاة الدهان ، ومن ثم إضافة بقية العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعليق لنقل أنبوب microfuge 1.5mL وتدور في ل10min 12000 XG في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وفي الوقت نفسه ، وإعداد 2mL - microfuge الأنابيب العازلة التي تحتوي على 1.5mL استخراج # 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طاف إزالة أنبوب من نسج (الخطوة 2.7) ووقف بيليه في 300μL العازلة من استخراج # 3. أولا إضافة كمية صغيرة من المخزن رقم 3 ، تعليق بيليه مع فرشاة الدهان ، ومن ثم إضافة العازلة المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعناية الماصة الموقوف بيليه (الخطوة 2.9) على أعلى من استخراج 1.5 مل العازلة # 3 أعدت في الخطوة 2.8. تأكد من مرحلتين وعدم الاختلاط. تدور في ل1H 16000 XG في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف بيليه وتعليق لونين مع فرشاة الدهان في 300μL من صوتنة العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يصوتن لونين مع sonotrode ، أو في حمام بالموجات فوق الصوتية ، إلى حجم الحمض النووي ل400bp تقريبا. عندما sonicating ، وجعل لونين لا شك سوف تكون ساخنة فوق 30 درجة مئوية تقريبا لحماية حساسة للحرارة crosslinks. مدة صوتنة يجب أن يكون تجريبيا ، لأنه يختلف اختلافا كبيرا بين الأجهزة صوتنة مختلفة. للتوجيه ، وتقدم ضبط جهازين مختلفين : </li></ol><p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> لصوتنة مع العلامة التجارية لونين Bandelin فضح sonotrode في أنبوب microfuge 0.6mL خمس مرات إلى 20 رشقات نارية مع إعدادات الطاقة بنسبة 25 ٪ ، ودورة = 50. عند القيام بذلك ، عينة باردة بعد كل رشقات نارية <sup>ال</sup> 20 في حمام جليدي. </p><p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> لصوتنة مع حمام Bioruptor Diagenode بالموجات فوق الصوتية ، وملء حوض الاستحمام بالماء والثلج ويصوتن عشر مرات لمدة 30 ثانية في أنابيب microfuge 1.5mL مع الإعداد "مرتفع". بعد كل 30 ثانية ، وعينات أخرى لتبريد 30 ثانية. </p><ol start="13" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> sonicated تدور في عينة ل5min ز 16000 في 4 درجات مئوية لترسيب المواد غير منحل. ويمكن مباشرة طاف تستعمل لمناعي. بدلا من ذلك ، يمكن أن تكون الصدمة عينات مجمدة في النيتروجين السائل وتخزينه في -80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى. </li></ol><p class="jove_title" style=";text-align:right;direction:rtl"> 3. مناعي </p><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد أنابيب microfuge 2 مل تحتوي على البروتين و40μL. agarose و1.8mL من الأجسام المضادة ملزم العازلة إضافة 200μL إعداد لونين (الخطوة 2.13). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب لاحتضان 1H على شاكر في سماء المنطقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل البروتين - A الخرز agarose واستخدام طاف للمناعي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة 40μL - قسامة لتحديد تركيز لونين ('إدخال'). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 30μL البروتين - A. agarose وكمية الأجسام المضادة المحددة التعديل الذي هو مبين في الجدول أدناه محددة من الكواشف والمعدات اللازمة لونين 400μL تعليق sonicated </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان ليلة وضحاها أو 2.5h على شاكر العامة في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور باستمرار في حبات ل2min ز س 440 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل حبة بيليه مع 900μL كل العازلة يغسل (انظر القائمة أدناه). لكل العازلة ، الخرز احتضان في المنطقة العازلة ل10min شاكر على النفقات العامة في 4 درجات مئوية ، وتدور في ذلك الحين ل2min 440 XG ، تجاهل طاف ، وإضافة العازلة المقبل. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العازلة منخفضة الملح تغسل </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العازلة عالية من الملح يغسل </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> LiCl غسل العازلة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> TE غسل العازلة </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد غسل النهائي ، تماما إزالة أي العازلة المتبقية. </li></ol><p class="jove_title" style=";text-align:right;direction:rtl"> 4. دي يشابك من histones والحمض النووي ، وتنقيتها من الحمض النووي عجلت </p><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100μL اجتثاث يشابك العازلة لبيليه agarose وعينة "الإدخال" ل40μl من الخطوة 3.4 ، مزيج ل5min على خلاط دوامة ، وعينات تدور ، وincuباتي عند 65 درجة مئوية خلال الليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقية الحامض النووي DNA مع مجموعة تجارية أو PCR تنقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عادة 5μl لتخفيف 01:05 من شطافة العمود الأخير كافية لأداء التقليدية موضع محدد في الوقت الحقيقي الكمية RT - PCR (RT - qPCR). </li></ol><p class="jove_title" style=";text-align:right;direction:rtl"> 5. جدول المخازن المؤقتة </p><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>يشابك العازلة</strong> </td></tr><tr><td> الصوديوم الزبدات </td><td> 10MM </td></tr><tr><td> السكروز </td><td> 400mM </td></tr><tr><td> تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 8.0 </td><td> 10MM </td></tr><tr><td> β - المركابتويثانول </td><td> 5mM </td></tr><tr><td> الفورمالديهايد </td><td> 3 ٪ (V / V) </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>العازلة استخراج # 1</strong> </td></tr><tr><td> الصوديوم الزبدات </td><td> 10MM </td></tr><tr><td> السكروز </td><td> 400mM </td></tr><tr><td> تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 8.0 </td><td> 10MM </td></tr><tr><td> β - المركابتويثانول </td><td> 5mM </td></tr><tr><td> إكمال البروتياز المانع </td><td> 1X </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>استخراج عازلة # 2</strong> </td></tr><tr><td> الصوديوم الزبدات </td><td> 10MM </td></tr><tr><td> السكروز </td><td> 250mM </td></tr><tr><td> تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 8.0 </td><td> 10MM </td></tr><tr><td> β - المركابتويثانول </td><td> 5mM </td></tr><tr><td> MgCl <sub>2</sub> </td><td> 10MM </td></tr><tr><td> تريتون X - 100 </td><td> 1 ٪ (W / V) </td></tr><tr><td> إكمال البروتياز المانع </td><td> 1X </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>العازلة استخراج # 3</strong> </td></tr><tr><td> الصوديوم الزبدات </td><td> 10MM </td></tr><tr><td> السكروز </td><td> 1.7M </td></tr><tr><td> تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 8.0 </td><td> 10MM </td></tr><tr><td> β - المركابتويثانول </td><td> 5mM </td></tr><tr><td> MgCl <sub>2</sub> </td><td> 2mm و </td></tr><tr><td> تريتون X - 100 </td><td> 0.15 ٪ (W / V) </td></tr><tr><td> إكمال البروتياز المانع </td><td> 1X </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>صوتنة العازلة</strong> </td></tr><tr><td> تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 8.0 </td><td> 25mM </td></tr><tr><td> EDTA - هيدروكسيد الصوديوم ، ودرجة الحموضة 8.0 </td><td> 5mM </td></tr><tr><td> SDS </td><td> 0.5 ٪ (W / V) </td></tr><tr><td> إكمال البروتياز المانع </td><td> 1X </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>العازلة الضد ملزمة</strong> </td></tr><tr><td> تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 8.0 </td><td> 50mM </td></tr><tr><td> EDTA - هيدروكسيد الصوديوم ، ودرجة الحموضة 8.0 </td><td> 1MM </td></tr><tr><td> كلوريد الصوديوم </td><td> 150mM </td></tr><tr><td> تريتون X - 100 </td><td> 0.1 ٪ (W / V) </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>العازلة منخفضة الملح تغسل</strong> </td></tr><tr><td> كلوريد الصوديوم </td><td> 150mM </td></tr><tr><td> SDS </td><td> 0.1 ٪ (W / V) </td></tr><tr><td> تريتون X - 100 </td><td> 1 ٪ (W / V) </td></tr><tr><td> EDTA - هيدروكسيد الصوديوم ، ودرجة الحموضة 8.0 </td><td> 2mm و </td></tr><tr><td> تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 8.0 </td><td> 20mM </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>العازلة عالية من الملح يغسل</strong> </td></tr><tr><td> كلوريد الصوديوم </td><td> 500mM </td></tr><tr><td> SDS </td><td> 0.1 ٪ (W / V) </td></tr><tr><td> تريتون X - 100 </td><td> 1 ٪ (W / V) </td></tr><tr><td> EDTA - هيدروكسيد الصوديوم ، ودرجة الحموضة 8.0 </td><td> 2mm و </td></tr><tr><td> تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 8.0 </td><td> 20mM </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>LiCl غسل العازلة</strong> </td></tr><tr><td> كلوريد الليثيوم </td><td> 250mM </td></tr><tr><td> Nonidet - P40 </td><td> 1 ٪ (V / V) </td></tr><tr><td> الصوديوم desoxycholate </td><td> 1 ٪ (W / V) </td></tr><tr><td> EDTA - هيدروكسيد الصوديوم ، ودرجة الحموضة 8.0 </td><td> 1MM </td></tr><tr><td> تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 8.0 </td><td> 20mM </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> <strong>TE غسل العازلة</strong> </td></tr><tr><td> EDTA - هيدروكسيد الصوديوم ، ودرجة الحموضة 8.0 </td><td> 10MM </td></tr><tr><td> تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 8.0 </td><td> 1MM </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> <strong>Decrosslinking العازلة</strong> </td></tr><tr><td> تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 6.8 </td><td> 62.5mM </td></tr><tr><td> كلوريد الصوديوم </td><td> 200MM </td></tr><tr><td> SDS </td><td> 2 ٪ (W / V) </td></tr><tr><td> DTT </td><td> 10MM </td></tr></tbody></table><p class="jove_title" style=";text-align:right;direction:rtl"> 6. ممثل النتائج : </p><p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> التعبير عن الجينات <em>thaliana Arabidopsis</em> الدفاع <em>PR2</em> ترميز β -وكان المستحث 1،3 - glucanase مع نشاط مضادات الميكروبات <sup>12</sup> ، قبل benzothiadiazole (BTH) ، والتناظرية الاصطناعية لمصنع حامض الساليسيليك هرمون <sup>3.</sup> <strong>الشكل 1</strong> يوضح أن تفعيل <em>PR2</em> التعبير يرتبط بزيادة في أستلة من بقايا يسين على هيستون H3 H4 وعلى المروج <em>PR2.</em> منذ انخفاض كثافة النيوكليوسومات أثناء تنشيط الجين <sup>13</sup> ، وتطبيع قيم أستلة هيستون للإشارة تم الحصول عليها مع أجسام مضادة لمنطقة ثابتة من 3 هيستون. </p><p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"><img src="/files/ftp_upload/3096/3096fig1.jpg" alt="الشكل 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 1"><br> <strong>الشكل 1 BTH يدفع أستلة هيستون على المروج في <em>PR2</em> Arabidopsis.</strong> وعولج النباتات مع BTH 100μM أو السيطرة مسحوق قابل للبلل. بعد 72H ، تم جمع الأوراق وكان معزولا لونين. وكان تطبيع إشارة تم الحصول عليها بعد هطول الأمطار مع الاجسام المضادة المحددة أستلة (كما هو مبين في الشكل) للإشارة التي تم الحصول عليها عن طريق الترسيب مع الضد إلى مجال ثابتة من H3 هيستون. وكان كميا لونين التي عجلت RT - qPCR. بيانات موحدة للمستويات تعديل هيستون في غياب العلاج BTH. </p>

<ol><li>Eberharter, A., Becker, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+acetylation%3A+a+switch+between+repressive+and+permissive+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+rep%22%5BJournal%5D)">Histone acetylation: a switch between repressive and permissive chromatin.</a> <em>EMBO rep</em>. <strong>3</strong>, 224-229 (2002).</li>
<li>Ruthenburg, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylation+of+lysine+4+on+histone+H3%3A+intricacy+of+writing+and+reading+a+single+epigenetic%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Methylation of lysine 4 on histone H3: intricacy of writing and reading a single epigenetic.</a> <strong>25</strong>, 15-30 (2007).</li>
<li>Jaskiewicz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modification+acts+as+a+memory+for+systemic+acquired+resistance+in+the+plant+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+rep%22%5BJournal%5D)">Chromatin modification acts as a memory for systemic acquired resistance in the plant stress response.</a> <em>EMBO rep</em>. <strong>12</strong>, 50-55 (2011).</li>
<li>Ng, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ordered+histone+modifications+are+associated+with+transcriptional+poising+and+activation+of+the+phaseolin+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Ordered histone modifications are associated with transcriptional poising and activation of the phaseolin promoter.</a> <em>Plant Cell</em>. <strong>18</strong>, 119-132 (2006).</li>
<li>Offermann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illumination+is+necessary+and+sufficient+to+induce+histone+acetylation+independent+of+transcriptional+activity+at+the+C4-specific+phosphoenolpyruvate+carboxylase+promoter+in+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Illumination is necessary and sufficient to induce histone acetylation independent of transcriptional activity at the C4-specific phosphoenolpyruvate carboxylase promoter in maize.</a> <em>Plant Physiol</em>. <strong>141</strong>, 1078-1088 (2006).</li>
<li>Deng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+histone+acetyltransferase+AtHAC1+in+the+regulation+of+flowering+time+via+repression+of+FLOWERING+LOCUS+C+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Involvement of the histone acetyltransferase AtHAC1 in the regulation of flowering time via repression of FLOWERING LOCUS C in Arabidopsis.</a> <em>Plant Physiol</em>. <strong>143</strong>, 1660-1668 (2007).</li>
<li>Benhamed, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+GCN5%2C+HD1%2C+and+TAF1%2FHAF2+interact+to+regulate+histone+acetylation+required+for+light-responsive+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis GCN5, HD1, and TAF1/HAF2 interact to regulate histone acetylation required for light-responsive gene expression.</a> <em>Plant Cell</em>. <strong>18</strong>, 2893-2903 (2006).</li>
<li>Bowler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+techniques+for+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Chromatin techniques for plant cells.</a> <em>Plant Journal</em>. <strong>39</strong>, 776-789 (2004).</li>
<li>Orlando, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+chromosomal+proteins+in+vivo+by+formaldehyde+decrosslinked-chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Mapping chromosomal proteins in vivo by formaldehyde decrosslinked-chromatin immunoprecipitation.</a> <em>Trends Biochem. Sci</em>. <strong>25</strong>, 99-104 (2000).</li>
<li>Haring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation%3A+optimization%2C+quantitative+analysis+and+data+normalization%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Meth%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization.</a> <em>Plant Meth</em>. <strong>3</strong>, 11-11 (2007).</li>
<li>Danker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+information+but+not+promoter+activity+controls+the+methylation+state+of+histone+H3+lysine+4+on+two+photosynthetic+genes+in+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Developmental information but not promoter activity controls the methylation state of histone H3 lysine 4 on two photosynthetic genes in maize.</a> <em>Plant J</em>. <strong>53</strong>, 465-474 (2008).</li>
<li>Uknes, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquired+resistance+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Acquired resistance in Arabidopsis.</a> <em>Plant Cell</em>. <strong>4</strong>, 645-656 (1992).</li>
<li>Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosome+displacement+in+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Develop%22%5BJournal%5D)">Nucleosome displacement in transcription.</a> <em>Genes Develop</em>. <strong>20</strong>, 2009-2017 (2006).</li>
</ol>

<p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> الإعلان عن أي تضارب في المصالح. </p>

<p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> أهم الخطوات في البروتوكول هي يشابك من الحمض النووي وhistones ، نوع وكمية المواد ورقة ، وطحن المواد ، وصوتنة من لونين. للاطلاع على مناقشة أكثر تفصيلا لهذه القضايا ، انظر الحكام. 9 و 10. </p><p class="jove_step" style=";text-align:right;direction:rtl"> صوتنة ويشابك : </p><p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> من المهم أن تعطيل لونين خلال صوتنة إلى شظايا من حوالي 400bp. سوف صوتنة تدمير شاملة لونين من خلال تعطيل الحمض النووي وhistones ، في حين سيغادر صوتنة كافية لونين شظايا طويلة. هذه تؤثر على خصوصية الأسلوب ، لأنه لا يمكن إدخال تعديلات بسيطة القاصية من موضع اختبار يكون هناك تمييز من التعديلات المحلية. يتم اختبار كفاءة صوتنة أفضل من خلال جمع عينات من لونين 20μL قبل وبعد صوتنة الحمض النووي دي يشابك ، وhistones وعزل الحمض النووي وتحديد طول الحمض النووي المنفصمة التي agarose هلام إستشراد. وينبغي أن يضاف إلى ريبونوكلياز عينات قبل الكهربائي ، لأن التحضير لونين لا يزال يحتوي على كميات كبيرة من الحمض النووي الريبي في هذه المرحلة من التنقية التي قد تتداخل مع التصور من الحمض النووي مجزأة. نماذج مفيدة للمناعي لونين إذا دنا من لونين غير المنفصمة أطول من 10kbp ، في حين أن الحمض النووي من لونين المنفصمة أشكال مسحة مع كثافة إشارة حول الأقصى 400bp من الحمض النووي. </p><p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> نستخدم عادة 3 ٪ (V / V) الفورمالدهيد لونين يشابك في أوراق سليمة ، ولكن 1 ٪ (V / V) الفورمالدهيد قد يكون كافيا في معظم الحالات. في أيدينا ، وتركيزات منخفضة الفورمالديهايد تسمح لأوقات أقصر صوتنة الخلفية والإشارات في تفاعلات PCR يترتب على ذلك. ومع ذلك ، كميات كافية من الفورمالديهايد في كثير من الأحيان نتيجة للتكرار منخفضة للإشارة PCR بين التجارب المستقلة. هذا قد يكون راجعا إلى عدم كفاية اختراق يترك مع الفورمالدهايد بتركيزات منخفضة. تأكد من أن البورصة الخاص الفورمالديهايد كثيرا ما يميل إلى مجمع تتبلمر مع مرور الوقت. الفورمالديهايد حلول مستقرة فقط لمدة شهر واحد تقريبا ، وتكاد هذه الفترة لفترات طويلة قبل تحقيق الاستقرار الميثانول. ينصح لاختبار تركيزات مختلفة الفورمالديهايد عند إعداد الشروط التجريبية. </p><p class="jove_step" style=";text-align:right;direction:rtl"> كمية من المواد النباتية وطحن : </p><p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> من المهم أن التسلل كميات قليلة من المواد لأوراق الشجر في كمية كبيرة من أوراق عازلة لتجنب الالتصاق مع بعضها البعض. أوراق شائكة غالبا ما يؤدي إلى عدم كفاية تسلل الفورمالديهايد. وعلاوة على ذلك ، فإن الكثير من المواد النباتية كتلة مسام النسيج miracloth. كفاءة طحن تعتمد بشكل كبير على استخدام قذائف المورتر ومدقة مع مثاليا. نحن عادة طحن مع النيتروجين السائل تبرد مدقة وهاون في غياب النتروجين السائل إضافية ثلاث مرات لمدة 50 ثانية حتى يتم الارض المادية إلى مسحوق ناعم. </p>

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم كاشف </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th><th> تعليقات </th></tr><tr><td> بروتين - A - Agarose </td><td> روش </td><td> 11 134 515 001 </td><td> يعتمد على الطبقة الأضداد </td></tr><tr><td> بروتين - G - Agarose </td><td> روش </td><td> 11 243 233 001 </td><td> يعتمد على الطبقة الأضداد </td></tr><tr><td> مكافحة hyperacetyl - H4 </td><td> ميليبور </td><td> 06-946 </td><td> استخدمنا 5μL </td></tr><tr><td> المضادة للأسيتيل H4K5 </td><td> ميليبور </td><td> 07-327 </td><td> استخدمنا 5μL </td></tr><tr><td> المضادة للأسيتيل H4K8 </td><td> ميليبور </td><td> 07-328 </td><td> استخدمنا 5μL </td></tr><tr><td> المضادة للأسيتيل H4K12 </td><td> ميليبور </td><td> 07-595 </td><td> استخدمنا 5μL </td></tr><tr><td> المضادة للأسيتيل H4K16 </td><td> ميليبور </td><td> 07-329 </td><td> استخدمنا 5μL </td></tr><tr><td> المضادة للأسيتيل H4K18 </td><td> ميليبور </td><td> 07-354 </td><td> استخدمنا 1μL </td></tr><tr><td> المضادة للأسيتيل H3K9 </td><td> ميليبور </td><td> 07-352 </td><td> استخدمنا 5μL </td></tr><tr><td> المضادة للأسيتيل H3K14 </td><td> ميليبور </td><td> 07-353 </td><td> استخدمنا 1μL </td></tr><tr><td> المضادة للثلاثي ، H3K4 </td><td> Diagenode </td><td> PAB - 003-50 </td><td> استخدمنا 5μL </td></tr><tr><td> المضادة للثنائي ميثيل - H3K4 </td><td> ميليبور </td><td> 07-030 </td><td> استخدمنا 5μL </td></tr><tr><td> مكافحة monomethyl - H3K4 </td><td> Abcam </td><td> ab8895 </td><td> 2،5 - 10μL </td></tr><tr><td> مكافحة H3 </td><td> Abcam </td><td> ab1791 </td><td> استخدمنا لفحص كثافة 1μL هيستون </td></tr><tr><td> Bioruptor </td><td> Diagenode </td><td> UCD TO - 200 </td><td></td></tr><tr><td> Sonotrode MS72 </td><td> Bandelin </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Miracloth </td><td> Calbiochem </td><td> 475855 </td><td></td></tr><tr><td> إكمال البروتياز المانع </td><td> روش </td><td> 11836145001 </td><td></td></tr></tbody></table>

الكشف عن تعديلات بسيطة في أوراق النبات

Detection of Histone Modifications in Plant Leaves

<p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> هيكل لونين من المهم لتنظيم التعبير الجيني في حقيقيات النوى. في هذه العملية ، إعادة عرض لونين ، الحامض النووي ، والتساهمية التعديلات على ذيول الأميني من محطة H3 H4 histones وتلعب أدوارا أساسية <sup>1-2.</sup> H3 H4 وتشمل التعديلات هيستون مثيلة ليسين وأرجينين ، أستلة من ليسين ، والفسفرة مخلفات سيرين <sup>1-2.</sup> وترتبط هذه التعديلات إما مع تنشيط الجينات ، والقمع ، أو دولة معبى من الجين الذي يعتمد التنشيط أكثر سرعة وقوة في التعبير بعد إدراك الإشارات المناسبة (ميكروب المرتبطة بأنماط الجزيئية ، والضوء ، والهرمونات ، وغيرها) <sup>3-7.</sup> </p><p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> هنا ، فإننا نقدم وسيلة للكشف عن موثوقة وحساسة من تعديلات محددة على لونين جينات النباتات المختارة. وتستند هذه التقنية على يشابك من (تعديل) والحمض النووي histones مع <sup>8،9</sup> الفورمالديهايد ، واستخراج وصوتنة من لونين ، لونين مناعي (رقاقة) مع الاجسام المضادة المحددة تعديل <sup>9،10</sup> ، دي يشابك المجمعات الدنا هيستون ، و جينات محددة في الوقت الحقيقي PCR الكمي. وقد أثبت هذا النهج مفيدا للكشف عن تعديلات بسيطة محددة مرتبطة C <sub>4</sub> الضوئي <sup>5،11</sup> في الذرة والحصانة الشاملة في <sup>3</sup> Arabidopsis. </p>

<p class="jove_content">يوصف منهج موثوق بها ومفيدة للكشف عن تعديلات بسيطة على الجينات النباتية محددة. نهج يجمع بين لونين مناعي (رقاقة) في الوقت الحقيقي وPCR الكمي. فإنه يسمح الكشف عن تعديلات بسيطة على جينات معينة لها دور في العمليات الفسيولوجية المختلفة.</p>

تعد بنية الكروماتين مهمة لتنظيم التعبير الجيني في حقيقيات النوى. وفي هذه العملية، يعمل إعادة تشكيل الكروماتين، ومثيلة الحمض النووي (DNA methylation)، والروابط التساهمية...

<p>توفر الطريقة التالية كشفاً موثوقاً وحساساً لتعديلات كروماتينية محددة في جينات نباتية مختارة. أولاً، يتم الربط المتبادل للهيستونات المعدلة والحمض النووي DNA باستخدام الفورمالديهايد. بعد ذلك، يتم استخلاص الكروماتين ومعالجته بالموجات فوق الصوتية لتسهيل عملية الترسيب المناعي باستخدام أجسام مضادة متخصصة في تلك التعديلات.</p><p>أخيرًا، قم بتحليل تفاعل ChIP عن طريق الربط المتصالب لمعقدات الهيستون والحمض النووي DNA وقياس التفاعل البوليميرازي المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي الخاص بجينات معينة. في النباتات، يمكن أن يوفر هذا النهج رؤى جزيئية مثل تعديلات الهيستون المحددة المرتبطة بعملية التمثيل الضوئي C4 في الذرة والمناعة الجهازية في Arabidopsis. وتتمثل الميزة الرئيسية لترسيب الكروماتين المناعي مقارنة بالطرق الحالية مثل قياس الطيف الكتلي في أن هذه التقنية تسمح بالكشف عن تعديلات الهيستون في تسلسلات مختارة داخل الجينوم النباتي.</p><p>بشكل عام، قد يواجه الأفراد المبتدئون في هذه الطريقة بعض الصعوبات لأن البروتوكول يتضمن عدة خطوات يعد أداؤها الصحيح مفتاحاً لنجاح الإجراء. في هذا الفيديو، نستخدم تحليل chip لتوفير رؤية حول خلل تنظيم التعبير الجيني في النبات النموذجي Arabidopsis ANA، ويقوم بشرح الإجراء mic yakovich، وهو طالب دكتوراه. لكل عينة، ابدأ بحصاد جرامين من أوراق arabidopsis ووضعها في أنبوب بلاستيكي سعة 50 milliliter. املأ الأنبوب بمحلول التثبيت (crosslinking buffer) حتى علامة 40 milliliter، وضع إسفنجة ترشيح مجهزة مباشرة فوق سطح المحلول لضمان بقاء الأوراق مغمورة.</p><p>الآن، ضع العينات في مجفف تحت التفريغ وقم بالترشيح لمدة 10 دقائق. لإيقاف تفاعل التشابك، أضف 2.5 milliliters من glycine بتركيز two molar واخلط عن طريق القلب. بعد ذلك، قم بالترشيح مرة أخرى لمدة خمس دقائق، مع الاستمرار في التفريغ، ثم ارشح لمدة خمس دقائق أخرى.</p><p>بعد ذلك، تخلص من السائل مع تجميع الأوراق باستخدام منخل. وبعد غسل الأوراق مرتين باستخدام لتر واحد من الماء في بيكر بلاستيكي، جفف الأوراق جيدًا باستخدام مناشف ورقية، ثم اجمع الأوراق في أنبوب بلاستيكي جديد وجمدها في نيتروجين سائل. تُحفظ العينات عند درجة حرارة -80 °C حتى عملية عزل الكروماتين.</p><p>باستخدام هاون ومدقة مبردين بالنيتروجين السائل، اطحن العينات المجمدة حتى تتحول إلى مسحوق ناعم. انقل المسحوق إلى أنبوب بلاستيكي سعة 50 milliliter. قم بتعليق المسحوق في 30 milliliters من محلول الاستخلاص المنظم رقم واحد، ثم حضن المزيج لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C على هزاز علوي.</p><p>مرر المعلق عبر أربع طبقات من قماش ميرور (mirror cloth) في أنبوب بلاستيكي جديد سعة 50 milliliter. بعد عملية الطرد المركزي، تخلص من السائل الطافي (SUP natin). بعد ذلك، استخدم فرشاة رسم لإعادة تعليق الراسب في 50 microliters من محلول الاستخلاص المنظم رقم 2، ثم أضف 950 microliters أخرى من محلول الاستخلاص المنظم.</p><p>ثانياً، انقل المعلق إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 milliliter وقم بالطرد المركزي لمدة 10 دقائق. في هذه الأثناء، جهز أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 2 milliliter تحتوي على 1.5 milliliters من محلول الاستخلاص المنظم. ثالثاً.</p><p>بعد ذلك، تخلص من السوائل الطافية لتعليق الراسب تدريجياً في 300 microliters من محلول استخلاص منظم. رقم ثلاثة. أولاً، أضف حجماً صغيراً من المحلول المنظم.</p><p>ثالثاً، قم بتعليق الراسب باستخدام فرشاة رسم ثم أضف ما تبقى من المحلول المنظم. الآن، ضع العينات بعناية في طبقات فوق الأنابيب المجهزة التي تحتوي على 1.5 milliliters من محلول الاستخلاص المنظم. ثالثاً، مع التأكد من عدم اختلاط الطورين، قم بطرد العينات مركزياً لمدة ساعة واحدة عند 16,000 ×g في درجة حرارة 4 °C.</p><p>تخلص من السائل الطافي وقم بتعليق حبيبات الكروماتين باستخدام فرشاة رسم في 300 µL من محلول التفتيت بالموجات فوق الصوتية (sonication buffer)، ثم قم بتفتيت الكروماتين حتى يصل حجم DNA إلى 400 base pairs تقريبًا. عند التفتيت، تأكد من عدم تسخين الكروماتين فوق 30 °C تقريبًا. ولحماية الروابط التشابكية الحساسة للحرارة، قم بطرد العينة المفتتة مركزياً لترسيب المواد غير الذائبة، ثم اجمع السائل الطافي في أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 2 mL تحتوي على protein agarose ومحلول ربط الأجسام المضادة (antibody binding buffer).</p><p>أضف 200 µL من تحضيرة كروماتين العينة. حضن الأنابيب لمدة ساعة واحدة على هزاز علوي. بعد عملية الطرد المركزي، اجمع السوائل الطافية من العينة وخذ حصة قدرها 30 µL من البروتين.</p><p>انقل إلى أنابيب جديدة سعة 1.5 milliliter لتحديد تركيز الكروماتين في المادة المدخلة. احتفظ بـ 40 µL من الكروماتين الذي تم تعريضه للموجات فوق الصوتية. بعد ذلك، أضف 400 µL من معلق الكروماتين المعالج بالموجات فوق الصوتية إلى 30 µL من محلول البروتين وكمية مناسبة من الجسم المضاد النوعي للتعديل، ثم قم بالتحضين طوال الليل على هزاز علوي عند درجة حرارة 4 °C.</p><p>يتم حصاد الخرز عن طريق الطرد المركزي لمدة دقيقتين عند 440 ×g. يتم التخلص من السائل الطافي وإجراء غسلات متتالية لراسب الخرز لمدة 10 دقائق باستخدام 900 µL من المنظم المقابل على هزاز علوي. بعد الغسلة الأخيرة، يتم إزالة أي منظم متبقٍ تماماً. لتحرير DNA من الهيستونات، يضاف 400 µL من منظم فك الربط المتقاطع D إلى الخرز وعينة الإدخال بحجم 40 µL التي تم حفظها مسبقاً، ثم يتم الخض بالدوامة لمدة خمس دقائق، وطرد العينات مركزياً، وتحضينها عند 65 °C طوال الليل.</p><p>الآن، قم بتنقية الـ DNA باستخدام طقم تنقية DNA تجاري، وأجرِ تفاعل R-T-P-C-R الكمي في الوقت الحقيقي النوعي للموقع التقليدي. في هذا المثال، تم تحفيز تعبير جين الدفاع ANA PR two في نبات Arabidopsis بواسطة Benzo Diaz ole، وهو نظير اصطناعي لهرمون حمض الساليسيليك النباتي. وتظهر النتائج أن تنشيط تعبير PR two يرتبط بزيادة في أسيلة بقايا الليسين على الهستونات H three و H four في محفز PR two.</p><p>أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر أن إضافة محلول الاستخلاص المنظم الأول (extraction buffer one) إلى مسحوق الأوراق يتسبب في زيادة الضغط داخل أنبوب fcon المغلق. يرجى تذكر فتح الأنبوب من حين لآخر. كما يجب تذكر عدم إزالة فرشاة الطلاء بعد تعليق الراسب وقبل إضافة المحلول المنظم التالي.</p><p>بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد تعديلات الهيستون، ومستويات الارتباط من خلال الربط التشابكي المعتمد على الفورمالدهيد للحمض النووي DNA والهيستونات، وعزل الترسيب المناعي للكروماتين، والتقدير الكمي للحمض النووي DNA في مواقع محددة للإجابة على أسئلة رئيسية حول دور الكروماتين وتعديلاته في مجالات مختلفة من بيولوجيا النبات.</p>

detection-of-histone-modifications-in-plant-leaves

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

نحن هنا وصف بروتوكول لتنقية وتوصيف المجمعات البروتين النباتي. علينا أن نظهر ذلك من خلال immunoprecipitating بروتين واحد ضمن مجمع، حتى نتمكن من تحديد التعديلات في مرحلة ما بعد متعدية والشركاء التفاعل فيها.

تحديد التعديلات بعد متعدية من النباتات بروتين المجمعات

نحن نقدم هنا بروتوكول فعالة وموثوق بها لالمناعية، مضان التهجين في الموقع، وتلطيخ DNA تليها الكمية، التصوير ذات الدقة العالية في نبات الأرابيدوبسيس البويضات thaliana كله جبل. وقد استخدم هذا الأسلوب بنجاح لتحليل التعديلات لونين والهندسة المعمارية النووية.

وسيلة فعالة للالكمي، التحليل خلية واحدة من لونين تعديل والعمارة النووية في جبل لالجامع بويضات في<em&gt; نبات الأرابيدوبسيس</em

مناعي لونين هي تقنية قوية لتحديد المواقع DNA من البروتينات في الجسم الحي نبات الأرابيدوبسيس ملزمة. ويشمل هذا الإجراء لونين عبر ربط والتشرذم، مناعي مع الأجسام المضادة انتقائية ضد البروتين من الفائدة، وتحليل QPCR من الحمض النووي ملزمة. نحن تصف مقايسة الشذرة بسيط الأمثل لمحطات نبات الأرابيدوبسيس.

مناعي لونين الفحص لتحديد نبات الأرابيدوبسيس التفاعلات-DNA البروتين<em&gt; في فيفو</em

ويعرض هذا البروتوكول على سير العمل متكامل للتميز هيستون التعديلات بعد متعدية باستخدام مطياف الكتلة (MS). يتضمن سير العمل تنقية هيستون من مزارع الخلايا أو الأنسجة، اشتقاق هيستون والهضم، وتحليل MS باستخدام النانو تدفق اللوني السائل وتعليمات لتحليل البيانات. تم تصميم بروتوكول لاستكمال غضون 2 - 3 أيام.

سير العمل كاملا لتحليل هيستون التعديلات بعد متعدية عن طريق أسفل إلى أعلى الطيف الكتلي: من هيستون استخراج لتحليل البيانات

وقد تم تطوير البروتوكول لاستخراج فعال histones سليمة من مواد أوراق الذرة الرفيعة لتحديد ملامح التعديلات اللاحقة الهيستون التي يمكن أن تكون بمثابة علامات اللاجينية المحتملة للمساعدة في هندسة المحاصيل المقاومة للجفاف.

عزل هيستون من نسيج أوراق الذرة الرفيعة لقياس الطيف الكتلي العلوي لأسفل من العلامات اللاجينية المحتملة

هنا، نقدم بروتوكولا لتحليل التوزيع على نطاق الجينوم لتعديلات الهستون، والتي يمكن أن تحدد الجينات المستهدفة الجديدة في مسببات الأمراض من M. oryzae وغيرها من الفطريات الخيطية.

تحليل على نطاق الجينوم لتوزيع تعديلات الهستون باستخدام طريقة تسلسل المناعة الكروماتين في <em>ماغنابورتي أوريزاي</em>

الانقسام تحت الأهداف ووضع العلامات (CUT &amp; Tag) هو استراتيجية تنميط الكروماتين فوق الجينومية الفعالة. يقدم هذا البروتوكول استراتيجية CUT &amp; Tag محسنة لتحديد ملامح تعديلات الهيستون في النباتات.

توصيف تعديل H3K4me3 في النباتات باستخدام الانقسام تحت الأهداف والوسم

يوضح هذا البروتوكول كيف يمكن استخدام نظام زراعة الخلايا ثلاثي الأبعاد لنمذجة ومعالجة وتحليل تعديلات الكروماتين في حالة شبه فسيولوجية.

تحديد كمي على المستوى العالمي لتعديلات ما بعد الترجمة Histone في نموذج زراعة الخلايا 3D للأنسجة الكبدية

نقل طاقة الرنين الفلوري (FRET) هو تقنية تصوير للكشف عن تفاعلات البروتين في الخلايا الحية. هنا ، يتم تقديم بروتوكول FRET لدراسة ارتباط الإنزيمات المعدلة للهيستون بعوامل النسخ التي تجندها إلى المروجين المستهدفين للتنظيم اللاجيني للتعبير الجيني في الأنسجة النباتية.

دراسة التفاعلات بين إنزيمات هيستون المعدلة وعوامل النسخ <em>في الجسم الحي</em> عن طريق نقل طاقة الرنين الفلوري

سير عمل تحليلي يعتمد على الكروماتوغرافيا السائلة ، ومطياف حركة الأيونات المحاصرة ، وقياس الطيف الكتلي لوقت الرحلة (LC-TIMS-ToF MS / MS) للحصول على ثقة عالية وتحليل "من أسفل إلى أعلى" قابل للتكرار للغاية لتعديلات الهستون وتحديد الهوية بناء على المعلمات الرئيسية (وقت الاحتفاظ [RT] ، المقطع العرضي للتصادم [CCS] ، ونسبة الكتلة إلى الشحنة الدقيقة [m / z]).

فحص تعديل الهستون باستخدام اللوني السائل ، ومطياف حركة الأيونات المحاصرة ، وقياس الطيف الكتلي لوقت الرحلة

يصف هذا البروتوكول نهجا عالي الإنتاجية لتقييم تسرب أيونات النبات، ونشاط البيروكسيداز، وإنتاج الكالوز في نفس العينة.

تقييم استجابات الأوراق للمستقلبات الثانوية الميكروبية باستخدام تنسيق عالي الإنتاجية

اكتشف طريقة كروماتين المناعي الترسيب لتحديد تعديلات الهيستون في جينات النباتات باستخدام Arabidopsis. توفر هذه التقنية رؤى جزيئية حاسمة حول تنظيم التعبير الجيني والاستجابات الفسيولوجية.

الكشف عن تعديلات بسيطة في أوراق النبات

استكشف المزيد من الفيديوهات