اختبار في المختبر لتقييم السمية الخلوية للخلايا القاتلة الطبيعية ضد الخلايا السرطانية

خذ صفيحة متعددة الآبار تحتوي على خلايا قاتلة طبيعية وخلايا سرطانية. تحتوي آبار التحكم على خلايا سرطانية فقط.

جهاز طرد مركزي لتسهيل الاتصال الخلوي.

حضن. ترتبط المستقبلات المنشطة على الخلايا القاتلة الطبيعية بالروابط السطحية للخلايا السرطانية ، مما يؤدي إلى تحفيز الخلايا القاتلة الطبيعية على إطلاق حبيبات تحتوي على جزيئات سامة للخلايا.

تخلق هذه الجزيئات مسام غشاء الخلايا السرطانية وتحفز موت الخلايا المبرمج الذي يطلق محتويات داخل الخلايا ، بما في ذلك نازعة هيدروجين اللاكتات ، أو LDH.

أضف منظفا لتحلل الخلايا السرطانية في آبار التحكم لتحقيق أقصى قدر من إطلاق LDH.

جهاز طرد مركزي ونقل جزء من المواد الطافية المحتوية على LDH إلى لوحة فحص.

أضف كاشف الفحص واحتضانه.

يحول LDH اللاكتات إلى بيروفات مما يقلل NAD +. يستخدم Diaphorase NADH لتقليل ملح التيترازوليوم ، وتشكيل منتج فورمازان أحمر اللون.

أضف محلولا حمضيا لإيقاف التفاعل الأنزيمي.

استخدم قارئ الألواح الدقيقة لقياس امتصاص الفورمازان في الآبار.

تتناسب شدة الفورمازان مع عدد الخلايا السرطانية المحللة في بئر الاختبار ، مما يشير إلى السمية الخلوية للخلايا القاتلة الطبيعية ضد الخلايا السرطانية.

أولا ، احصل على لوحة 96 بئرا معالجة بالثقافة مستديرة القاع ، وقم بإعدادها كما هو موضح في الجدول 1 من بروتوكول النص. قم بالطرد المركزي للوحة الفحص عند 250 مرة جم لمدة 4 دقائق للتأكد من أن المستجيب والخلايا المستهدفة على اتصال. بعد ذلك ، قم باحتضان اللوحة في غرفة مرطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 5 ساعات.

قبل 45 دقيقة من حصاد المواد الطافية ، أضف 10 ميكرولترات من محلول التحلل 10x إلى آبار إطلاق LDH القصوى للخلية المستهدفة ، وأعد اللوحة إلى الغرفة المرطبة. عند اكتمال الحضانة ، قم بالطرد المركزي للوحة بمعدل 250 مرة جم لمدة 4 دقائق. بعد ذلك، استخدم ماصة متعددة القنوات لنقل حصص سعة 50 ميكرولترا من كل بئر إلى لوحة فحص جديدة ذات قاع مسطح مكون من 96 بئرا.

أضف 50 ميكرولترا من كاشف الفحص إلى كل بئر من لوحة الفحص. غطي الطبق بورق الألمنيوم لحمايته من الضوء ، واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، أضف 50 ميكرولترا من محلول التوقف إلى كل بئر. تأكد من قراءة اللوحة في غضون ساعة واحدة من إضافة محلول التوقف وتسجيل الامتصاص عند 490 نانومتر.