تقنية لتوليد الخلايا التائية المستضدات الخيمرية الخاصة بالمستضد

خذ صفيحة ميكروويل مغطاة بشظايا فيبرونيكتين مؤتلفة وأضف الخلايا التائية المنشطة CD8 الإيجابية.

إدخال نواقل الفيروسات القهقرية التي تحتوي على الحمض النووي الريبي المعدل وراثيا الذي يشفر مستقبلات مستضد خيمرية أو CAR.

قم بتغطية اللوحة وأغلقها في كيس لتجنب التلوث. الطرد المركزي للوحة بسرعة منخفضة لتسهيل التفاعل بين الخلايا الفيروسية.

يرتبط الفيبرونيكتين بالفيروس والخلية ، ويتموضع معهما لتعزيز نقل الجينات بوساطة الفيروس.

بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة الكيس المغلق واحتضان اللوحة في ظل الظروف الفسيولوجية.

يندمج غلاف الناقل الفيروسي مع غشاء الخلية ، ويطلق الحمض النووي الريبي الفيروسي والإنزيمات.

تقوم

الإنزيمات الفيروسية بنسخ الحمض النووي الريبي المنبعث عكسيا ودمج الحمض النووي الناتج في جينوم المضيف ، مما يمكن الخلايا من التعبير عن CARs المرتبطة بالسطح.

يشتمل CAR على مجال ربط مستضد خاص بالمستضد المستهدف ومجالات الإشارات لتنشيط الخلايا التائية.

خلايا CAR T الخاصة بالمستضد جاهزة للمقايسات النهائية

في اليوم الأول ، قم بإعداد ألواح الفيبرونيكتين البشرية المغلفة بشظايا عن طريق إضافة 0.5 مل من الفيبرونيكتين إلى آبار صفيحة مكونة من 24 بئرا واحتضانها طوال الليل عند 4 درجات مئوية.

في اليوم التالي ، قم بإزالة محلول الفبرونيكتين وأضف 1 مليلتر من 2٪ BSA في PBS لكل بئر. احتضن اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة ، واغسل الآبار المعالجة ب 1 مليلتر من PBS المعقم. اللوحة جاهزة للاستخدام بعد إزالة محلول الغسيل.

عد خلايا CD8 T المنشطة باستخدام طبقة الطبعة الزرقاء. اجمعها عن طريق الطرد المركزي ، وأعد تعليقها عند 5 ملايين خلية قابلة للحياة لكل مليلتر للنقل. أضف 100 ميكرولتر من معلق خلية CD8 المنشط إلى كل بئر من الصفيحة المطلية بالفبرونكتين. ثم أضف 1.5 إلى 2 مل من الوسط المحتوي على الفيروس المحضر مسبقا ، واخلطه باستخدام حركة دوامة لتوزيع الخلايا بالتساوي.

أغلق اللوحة في كيس بسحاب وقم بطردها بحرارة 2000 مرة جم لمدة 90 دقيقة عند 37 درجة مئوية. قم بإزالة اللوحة من جهاز الطرد المركزي واصطحبها إلى خزانة السلامة البيولوجية. قم بإزالة الكيس البلاستيكي بعناية وتأكد من أن الجزء الخارجي من اللوحة غير ملوث بالوسط. انقل اللوحة إلى حاضنة ثاني أكسيد الكربون 37 درجة مئوية.

بعد 4 ساعات ، قم بإزالة 1 مليلتر من الوسط من كل بئر. استبدله ب 1 ملليلتر من وسط الخلية التائية الكاملة الدافئة مسبقا وأعد اللوحة إلى الحاضنة.