تنقية الجسيمات النانوية البروتينية ذاتية التجميع باستخدام كروماتوغرافيا التقارب

خذ تعليقا من البكتيريا المهندسة التي تعبر عن جزيئات البروتين النانوية المؤتلفة ذاتية التجميع مع علامات البولي هيستيدين.

سونيكات لإطلاق المكونات داخل الخلايا.

جهاز طرد مركزي لجمع المادة الطافية التي تحتوي على جزيئات البروتين النانوية. قم بتخفيفه باستخدام مخزن مؤقت خال من الإيميدازول.

خذ عمودا كروماتوغرافيا متقاربا يحتوي على حبات الاغاروز مع كاتيونات النيكل المجمدة.

أضف حاجزا بتركيز إيميدازول منخفض لتوازن الأعمدة.

أضف المحلل البكتيري إلى العمود.

أثناء التشغيل ، يرتبط البولي هيستيدين على الجسيمات النانوية البروتينية بقوة مع كاتيونات النيكل.

وفي الوقت نفسه ، ترتبط الملوثات مثل عديدات السكاريد الدهنية البكتيرية والبروتينات الأخرى بشكل ضعيف بالعمود.

يغسل بمخزن مؤقت يحتوي على تركيز إيميدازول منخفض لإزالة البروتينات ضعيفة الارتباط.

أدخل الأيزوبروبانول لإزالة عديدات السكاريد الدهنية ثم غسلها.

بعد ذلك ، أدخل عازلة بتركيز إيميدازول متوسط. يتنافس الإيميدازول مع الهيستيدين للارتباط بكاتيون النيكل ، وإطلاق جزيئات البروتين النانوية المقلدة.

بعد ذلك ، أضف عازلة تحتوي على تركيز عال من إيميدازول لتصفية الجسيمات النانوية للبروتين تماما.

اجمع جزيئات البروتين النانوية المنقاة لمزيد من التطبيق.

لتحلل الإشريكية القولونية المحصودة التي تعبر عن حزمة اللولب الستة SAPN ، استخدم مسبارا بإخراج صوتنة يبلغ 150 واط ، مع أربع ثوان من الصوتنة وست ثوان من الراحة لصوتنة الكريات البكتيرية المعلقة في 40 مل من المخزن المؤقت الخالي من إيميدازول على الجليد لمدة خمس دقائق.

قم بالطرد المركزي للمحللات الخلوية لتوليد مادة طافية واضحة ، ونقل المادة الطافية إلى قارورة معقمة سعة 150 مل. بعد ذلك ، قم برفع العينة إلى الحجم النهائي البالغ 100 مل مع مخزن مؤقت طازج خال من الإيميدازول.

لعزل البروتين محل الاهتمام ، افتح برنامج FPLC وانقر فوق طريقة جديدة اختيار. في القائمة إعدادات الطريقة، افتح القائمة المنسدلة موضع العمود وحدد C1 Port 3. في القائمة المنسدلة Shown By Technique، حدد Affinity. في القائمة المنسدلة نوع العمود، حدد Others وHisTrap HP وخمسة ملليلتر. سيتم ضبط حجم العمود وصناديق الضغط تلقائيا على القيم المناسبة.

انقر فوق مخطط الأسلوب واسحب أزرار Equilibration و Sample Application وأزرار Smooth Wash الثلاثة وزر Elution من القائمة المنبثقة Phase Library بجوار السهم، قبل إغلاق قائمة Phase Library. انقر فوق توازن وقم بتعيين القيم المدرجة في الجدول إلى المخزن المؤقت الأولي B، 4٪، المخزن المؤقت النهائي B، 4٪، وحجم العمود، 5.

انقر فوق نموذج التطبيق. في مربع تحميل العينة، انقر فوق زر الاختيار لحقن عينة على العمود باستخدام مضخة العينة وتأكد من تحديد المربع الموجود بجوار استخدام معدل التدفق من إعدادات الطريقة في حقن العينة مع صندوق مضخة النظام. قم بتغيير قيمة مربع الحجم إلى 100 ملليلتر ونظام تجميع الكسور إلى تمكين.

قم بإلغاء النقر فوق المربع استخدام حجم الكسر من إعدادات الطريقة وقم بتغيير حجم الكسر إلى أربعة ملليلتر. انقر فوق الزر الأول لغسل العمود. قم بتعيين القيم المدرجة في الجدول إلى المخزن المؤقت الأولي B، 4٪، المخزن المؤقت النهائي B، 4٪، ووحدة تخزين العمود، 10. انقر فوق المربع تمكين مخطط تجميع الكسور وقم بإلغاء النقر فوق استخدام حجم الكسر لإعدادات الأسلوب. قم بتغيير حجم الكسر إلى أربعة ملليلتر وانقر فوق الزر الثاني غسل الأعمدة.

قم بتعيين القيم في الجدول إلى المخزن المؤقت الأولي B، 0٪، المخزن المؤقت النهائي B، 0٪، ووحدة تخزين العمود، 5. انقر فوق المربع تمكين مخطط تجميع الكسور وقم بإلغاء النقر فوق استخدام حجم الكسر من إعدادات الأسلوب. قم بتغيير حجم الكسر إلى 4 ملليلتر وانقر فوق الزر "غسل العمود الثالث". قم بتعيين القيم الموجودة في الجدول إلى المخزن المؤقت الأولي B، 0٪، المخزن المؤقت النهائي B، 0٪، وحجم العمود، 10. انقر فوق الزر تمكين مخطط تجميع الكسور وقم بإلغاء النقر فوق المربع استخدام حجم الكسر لإعدادات الأسلوب. ثم قم بتغيير حجم الكسر إلى 4 ملليلتر.

انقر فوق الزر Elution وانقر بزر الماوس الأيمن فوق المعلومات الموجودة في الجدول. في القائمة المنبثقة، انقر فوق حذف الخطوة، واسحب زر التدرج المتساوي إلى الجدول مرتين بحيث يكون هناك إدخالان. قم بتعيين قيمة الإدخال الأول إلى المخزن المؤقت الأولي B، 30٪، المخزن المؤقت النهائي B، 30٪، ووحدة تخزين العمود، 10.

قم بتعيين قيمة الإدخال الثاني إلى المخزن المؤقت الأولي B، 100٪، المخزن المؤقت النهائي B، 100٪، وحجم العمود، 10. انقر فوق الزر تمكين مخطط تجميع الكسور ، وانقر فوق المربع استخدام حجم الكسر لإعدادات الأسلوب. ثم انقر فوق حفظ باسم وقم بتسمية الملف ، تنقية.

ضع أنبوب المضخة A من FPLC في مخزن الغسيل الخالي من الإيميدازول ، وأنبوب المضخة B في المخزن المؤقت إيميدازول 500 ملليمول. ضع أنبوب مضخة العينة في عينة 100 مل وقم بتشغيل برنامج التنقية. عند الحاجة إلى غسل الأيزوبروبانول بنسبة 60٪ ، أوقف البرنامج مؤقتا ، وانقل أنبوب المضخة من الغسيل الخالي من الإيميدازول إلى غسل الأيزوبروبانول بنسبة 60٪ ، وأعد تشغيل البرنامج. في نهاية الغسيل ، أوقف البرنامج مؤقتا مرة أخرى ، وأعد أنبوب المضخة A إلى مخزن الغسيل الخالي من الإيميدازول ، وأعد تشغيل برنامج التنقية.