موسوعة JoVE للتجارب
علم المناعة
0 مشاهدة • 5:34 دقيقة • July 8th, 2025
ابدأ بأنبوب فموي يحتوي على معلق من الخميرة الموجهة وراثيا غير القادرة على إنتاج قاعدة اليوراسيل النووية.
أدخل الأنبوب الفموي في فم الفأر المقيد ووجهه إلى المعدة.
قم بإدارة معلق الخميرة مباشرة في المعدة ، مما يسمح لها بالوصول في النهاية إلى الأمعاء الدقيقة.
تحتوي الأمعاء الدقيقة على خلايا ظهارية ، مع بقع باير الغنية بالخلايا المناعية.
الخلايا الدقيقة ، الخلايا الظهارية المعوية المتخصصة بالقرب من بقع باير ، تبتلع خلايا الخميرة وتستوعبها في حويصلات.
تتحرك هذه الحويصلات عبر الخلايا وتطلق خلايا الخميرة في رقعة باير الأساسية.
اعزل رقعة باير عن أمعاء الفأر المضحية واحصل على تعليق خلوي موحد.
استزراع معلق الخلية هذا على وسط انتقائي للخميرة يحتوي على اليوراسيل.
تستخدم الخميرة Auxotrophic اليوراسيل وتتكاثر لتشكيل مستعمرات ، مما يؤكد توصيل خلايا الخميرة المحولة إلى الجهاز المناعي المعوي للفأر.
بعد تحضير مزارع الخميرة وفقا لبروتوكول النص ، استخدم مقياس كثافة الدم لتحديد تركيز الخلية ، واضبط على 10 إلى الخلايا التاسعة لكل مليلتر. بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 2,500 مرة جم لمدة ثلاث دقائق. بعد ذلك ، اسكب المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا عن طريق إضافة الحجم المناسب من الماء المعقم ، وسحب العينة برفق لأعلى ولأسفل.
قم بتثبيت إبرة تزقيم قياس مناسبة على حقنة معقمة سعة 1 مليلتر ، وقم بتحميل عينة الخميرة ، والقضاء على أي فقاعات هواء. قم بتحميل حقنة إضافية بالماء المعقم لتزقيم الفئران المسؤولة عن التحكم. باستخدام اليد غير المهيمنة ، التقط الفأر ليتم تجنيده ، وباستخدام السبابة والإبهام ، أمسك الجلد بإحكام حول الرقبة. دس الذيل تحت الإصبع الصغير. تأكد من أن المقبض آمن ويمنع الماوس من تحريك رأسه.
بعد ذلك ، أدخل إبرة التزقيم برفق في مريء الفأر عن طريق تحريك الإبرة بزاوية على طول سقف الفم ومؤخرة الحلق ، مع الحفاظ قليلا على يسار المركز. انتظر حتى يبتلع الفأر لمبة الإبرة. إذا شعرت بالمقاومة أو شهق الفأر ، فقم بإزالة الإبرة برفق وحاول مرة أخرى العثور على المريء.
بعد أن يبتلع الفأر لمبة الإبرة المسننة ، اضغط برفق على مكبس المحقنة لإدارة الخميرة مباشرة في معدة الفأر. قم بإزالة إبرة التزقيم برفق من معدة الفأر والمريء وأعد الفأر إلى القفص. تأكد من أن الماوس يتنفس ويتحرك بشكل طبيعي للتأكد من إجراء التزقيم بشكل صحيح.
بعد التضحية بالفأر وفقا لبروتوكول النص ، ضعه مع تعرض البطن بالكامل واستخدم 70٪ من الإيثانول لرش منطقة البطن. باستخدام المقص ، قم بعمل شق عرضي من خلال الفراء والجلد. بعد ذلك ، قم بفتح الشق يدويا لكشف الصفاق ، بطانة المصل الرقيقة التي تغطي أعضاء البطن. ارفع الصفاق برفق وقم بعمل شق عرضي لكشف الأمعاء.
بعد ذلك ، استخدم ملقطا غير حاد لإثارة الأمعاء الدقيقة بعناية بعيدا عن الشرايين المساريقية والدهون والأنسجة الأخرى. كشف الأمعاء الدقيقة من المعدة في الربع العلوي الأيسر من بطن الفأر إلى الأعور ، وهو الجيب الكبير من الأنسجة المعوية في بداية الأمعاء الغليظة.
بعد ذلك ، اعزل بقع باير عن طريق البحث عن بقع دائرية تقريبا من 1 إلى 2 ملم من الأنسجة غير الشفافة على طول الأمعاء الدقيقة. بعد ذلك ، باستخدام مقص تشريح منحني ، قم بقطع قبة رقعة باير ، مع ترك هوامش لضمان عدم جمع أي من الأنسجة المحيطة.
انقل بقع باير التي تم تشريحها إلى IMDM كامل. بعد ذلك ، اسكب المحلول مع بقع باير المعلقة على مصفاة خلية 40 ميكرومتر. بعد غسل بقع باير باستخدام IMDM الكامل ، استخدم مكبسا من حقنة سعة 1 مليلتر لتفتيت الأنسجة برفق وجمع الخلايا في أنبوب سعة 50 ملليلترا. حبيبات الخلايا المتوترة عند 1,800 دورة في الدقيقة لمدة سبع دقائق. ثم انتظر وحلل الخلايا وفقا لبروتوكول النص.