موسوعة JoVE للتجارب
علم المناعة
0 مشاهدة • 4:21 دقيقة • July 8th, 2025
خذ ورم الورم الميلانيني في الفئران الذي يتكون من العدلات المرتبطة بالورم ، أو TANs.
تظهر TANs نشاطا مرتفعا لإنزيم نيكوتيناميد فوسفوريبوزيل ترانسفيراز ، أو NAMPT ، مما يحفز تكوين الأوعية الدموية ، وتكاثر الأوعية الدموية في الأورام ، ويسهل نمو الورم.
افرم الأنسجة وأضف الإنزيمات لتدهور مصفوفة الأنسجة ، وتخفيف الخلايا.
قم بتصفية التعليق من خلال مصفاة وجهاز طرد مركزي لتكسير الخلايا.
أضف عازلة للتحلل لتحلل خلايا الدم الحمراء ، ثم جهاز الطرد المركزي وتخلص من المادة الطافية التي تحتوي على بقايا الخلايا.
إدخال الأجسام المضادة لمنع مستقبلات Fc الخلوية ، وبالتالي تجنب التلوين المناعي غير المحدد.
أدخل كوكتيل أجسام مضادة تحمل علامة الفلوروفور مخصصا لعلامات السطح على TANs وصبغة لتمييز الخلايا الميتة.
باستخدام FACS ، قم بعزل TANs القابلة للحياة المسمى بالفلوروفور ونقلها إلى صفيحة دقيقة.
أضف مثبطا يمنع نشاط NAMPT إلى الآبار المحددة واحتضانه.
استخدم الخلايا لتقييم قدرتها على تحفيز تكوين الأوعية. تظهر TANs المعالجة بالمثبطات انخفاضا في تكوين الأوعية مقارنة ب TANs غير المعالجة.
لعزل العدلات المرتبطة بالورم ، ضع خمسة أورام لكل بئر في آبار فردية من صفيحة معقمة من ستة آبار ، حيث يتم حصادها ، واستخدم مقصا معقما لفرم الأورام إلى قطع من 2 إلى 3 ملليمترات. بعد ذلك ، قم بهضم شظايا الورم باستخدام 1 مليلتر من الكولاجيناز القائم على القرص ، ومحلول DNase I لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون مع الرطوبة ، وخلط العينات مع حقنة 10 ملليلتر كل 15 دقيقة.
في نهاية الحضانة ، قم بتصفية الخلايا من خلال مصافي 100 ميكرومتر في أنبوب واحد سعة 15 مليلتر لكل بئر لإزالة الألياف غير المهضومة ، وإضافة PBS إلى الحجم النهائي البالغ 15 ملليلترا. اجمع الخلايا المنفصلة عن طريق الطرد المركزي ، وقم بتحلل خلايا الدم الحمراء باستخدام 1 مليلتر من محلول التحلل لكل أنبوب.
بعد الخلط ، امزج محتويات كل أنبوب في أنبوب واحد سعة 15 مليلتر ، وإيقاف التفاعل بعد دقيقتين باستخدام 11 مل من وسط 4 درجات مئوية كامل. بعد الطرد المركزي ، أعد تعليق الحبيبات في 1 مليلتر من PBBS ، ومنع أي ارتباط غير محدد بثلاثة ميكرولترات من الأجسام المضادة المحجوبة بواسطة FC لمدة 15 دقيقة على الجليد.
في نهاية الحضانة ، قم بتسمية الخلايا بالأجسام المضادة ل CD11b و Ly6G وأي أجسام مضادة أخرى ذات أهمية بالإضافة إلى DAPI لمدة 30 دقيقة على الجليد المحمي من الضوء. في نهاية الحضانة ، اغسل الخلايا في 14 مل من PBS ، وأعد تعليق الكريات عند 1 × 107 خلايا لكل مليلتر من تركيز متوسط كامل طازج على الجليد.
بعد ذلك ، قم بفرز العدلات السلبية عالية Ly6G الإيجابية CD11b على فارز الخلايا المنشط بالفلورة وفقا لبروتوكولات الفرز القياسية ، والتحقق من نقاء العدلات المعزولة على مقياس التدفق الخلوي في نهاية الفرز. بالنسبة لتثبيط العدلات المرتبط بالورم في المختبر ، قم بالبذور 1.5 مرة 10 إلى العدلات الخامسة المصنفة في كل من بئرين من صفيحة قاع U مكونة من 96 بئرا ، وأضف FK866 إلى التركيز النهائي البالغ 100 نانومولار في وسط كامل في بئر واحد وحجم متساو من الوسط الكامل وحده إلى البئر الآخر. بعد ساعتين في حاضنة زراعة الخلايا ، اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS ، وأعد تعليق الكريات في PBS بالتركيز المناسب للحقن اللاحق.