تقنية اقتران أفيدين والبيوتين لتقديم المستضدات المستهدفة على المتفطرة بوفيس BCG

ابدأ بتعليق المتفطرة بوفيس BCG ، المعالجة بخافض للتوتر السطحي غير أيوني ، لمنع التكتل البكتيري.

بعد ذلك ، أضف كاشف البيوتينيل واحتضانه.

كاشف البيوتينيل هذا ، وهو مركب من البيوتين المركب إلى رابط وظيفي ، يسهل ربط جزيئات البيوتين بالبروتينات السطحية البكتيرية ، ووضع العلامات على البكتيريا.

بعد الحضانة ، قم بالطرد المركزي للتعليق البكتيري المسمى بالبيوتين لإزالة كاشف البيوتينيل غير المتفاعل.

أعد تعليق البكتيريا في مخزن مؤقت. أضف محلولا من بروتين أفيدين فيوجن ، وهو بروتين مؤتلف يشتمل على مجال مستضد مستهدف مدمج مع الأفيدين الأحادي.

أثناء الحضانة ، يرتبط أفيدين بالبيوتين ، مما يسهل تعديل سطح البكتيريا بالمستضدات المستهدفة.

الطرد المركزي المعلق لإزالة بروتينات الاندماج غير المرتبطة.

أعد تعليق البكتيريا المغلفة بالمستضد في مخزن مؤقت يحتوي على خافض للتوتر السطحي غير أيوني. يمكن أن يعزز طلاء المستضد على البكتيريا خصائصه لتحفيز الاستجابات المناعية.

اعمل في خزانة السلامة الحيوية باستخدام معدات الحماية الشخصية لأن BCG هو أحد مسببات الأمراض من المستوى الثاني.

لبيوتينيل سطح خلايا BCG ، أولا ، قم بزراعة الخلايا على منصة شاكر إلى الكثافة المناسبة. اجمع حوالي 1 مليار خلية ، واغسلها ثلاث مرات باستخدام 500 ميكرولتر من PBST الخالي من السموم الداخلية المثلجة. ثم قم بتدوير الخلايا وعلقها في PBS معقم خال من السموم الداخلية. بعد ذلك ، قم بإعداد بيوتين Sulfo-NHS SS الطازج 10 ملليمولار في ماء مصفى معقم. بعد ذلك ، احتضان البكتيريا في 1 مليلتر من المرق الذي يحتوي على 0.5 ملليمولار من بيوتين Sulfo-NHS SS. قم بإجراء الحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.

بعد ذلك ، اغسل البكتيريا المسماة الآن ثلاث مرات باستخدام 500 ميكرولتر من PBST المثلج ، لإزالة الكاشف غير المتفاعل. ثم, أعد تعليق الحبيبات في 1 مليلتر من PBST.

امزج 500 مليون BCG بيوتينيل مع بروتين اندماج أفيدين ، للحصول على تركيز نهائي قدره 10 ميكروغرام من البروتين لكل ملليلتر. دع هذا التفاعل يستمر لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة على شاكر. بعد ذلك ، اغسل البكتيريا ثلاث مرات باستخدام 500 ميكرولتر من PBST المثلج.