توليد خلايا CD8 T موجبة مفردة من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات

الجذعية المستحثة في الثقافة على طبقة مغذية من الخلايا اللحمية على مصفوفة الجيلاتين.

تحاكي الطبقة المغذية البيئة الطبيعية خارج الخلية ، وتوجه تمايز الخلايا الجذعية إلى عضيات على شكل قبة تحتوي على خلايا سلفية مكونة للدم.

أضف الإنزيمات لفصل الخلايا المزروعة المشتركة.

انقل الخلايا إلى طبق طازج مغطى بالجيلاتين للتصاق الخلايا اللحمة.

اجمع الخلايا السلفية المكونة للدم غير الملتصقة في وسط تمايز.

زرعها على طبقة تغذية جديدة لتعزيز تمايز الخلايا السلفية إلى خلايا تائية موجبة مزدوجة مع مستقبلات CD4 و CD8 والخلايا التائية السالبة المزدوجة التي تفتقر إلى كلا المستقبلين.

نقل الخلايا إلى أنبوب. احتضنها بخرز مغناطيسي تحمل أجساما مضادة خاصة ب CD4 والتي تضع علامات بشكل انتقائي على الخلايا التائية الإيجابية المزدوجة.

استخدم فاصلا مغناطيسيا لعزل الخلايا الموجبة المزدوجة وزراعتها على طبقة تغذية جديدة.

مكمل مع مزيج السيتوكين والأجسام المضادة لتحفيز الخلايا ، مما يؤدي إلى تقليل تنظيم مستقبلات CD4 وتعزيز تمايزها إلى خلايا موجبة CD8 مفردة.

قم بإعداد أطباق OP9-delta-1 الجيلاتينية قبل أسبوع واحد من الزراعة المشتركة مع IPSCs البشرية. أضف 4 ملليلتر من الجيلاتين 0.1٪ إلى ثلاثة أطباق جديدة لزراعة الخلايا ، واحتضنها لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد الحضانة ، استنشق الجيلاتين وأضف 8 مل من وسائط OP9 إلى كل طبق. قم بتمرير طبق واحد ملتقى من خلايا OP9-delta-1 إلى ثلاثة أطباق مغطاة بالجيلاتين.

بعد أربعة أيام ، أضف 10 ملليلتر من وسائط OP9 إلى كل طبق من الخلايا ليصبح المجموع 20 مل من الوسائط لكل طبق. ابدأ الزراعة المشتركة ل IPSC البشرية على أطباق التقاء OP9-delta-1 بعد سبعة إلى ثمانية أيام من مرور الخلايا. استنشق الوسائط من طبق ملتقى من IPSCs البشرية ، وأضف 10 مل من وسائط OP9.

قم بقص وفصل مستعمرات الخلايا باستخدام أداة مرور الخلايا التي تستخدم لمرة واحدة ، ونقل 350 إلى 600 كتلة من المستعمرات المقطوعة إلى طبق OP9-delta-1 مسبق الجلتين مع 10 مل من وسائط OP9 الطازجة. قم بتزيين طبق الثقافة جنبا إلى جنب ومن الأمام إلى الخلف لضمان التوزيع المتساوي للمستعمرات. في اليوم التالي ، استنشق الوسائط المستهلكة ، واستبدلها ب 20 مل من وسائط OP9 الجديدة.

يجب أن تظهر كتل IPSC البشرية المستزرعة بشكل مشترك على OP9-delta-1 ليوم واحد كمستعمرات صغيرة أحادية الطبقة مستديرة. في اليوم 5 ، استنشق 10 ملليلتر من الوسائط المستهلكة وأضف 10 ملليلتر من وسائط OP9 الجديدة. ستبدأ المستعمرات في التمايز إلى الأديم المتوسط البدائي ، والذي يتميز بمركز مظلم متعدد الطبقات.

كرر هذه العملية في اليوم 9 ، وعند هذه النقطة ستتطور الهياكل المركزية متعددة الطبقات إلى أشكال تشبه القبة. احصد الخلايا السلفية المكونة للدم في اليوم 13 ، وعند هذه النقطة تتكون الهياكل من عضوية مركزية داكنة محاطة بشبكة من المناطق الشبيهة بالقبة. استنشق الوسائط ، واغسل الخلايا مرة واحدة ب 5 ملليلتر من محلول ملح هانك المتوازن الخالي من الفينول باللون الأحمر مع الكالسيوم والمغنيسيوم أو HBSS.

بعد الغسيل ، أضف 250 ميكرولتر من 5,000 وحدة لكل مليلتر كولاجيناز -4 إلى 10 ملليلتر من HBSS. يضاف الخليط إلى الخلايا ويحتضنها على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة. استنشق خليط HBSS-collagenase ، واغسل الخلايا مرة واحدة ب 5 ملليلتر من PBS. بعد الغسيل باستخدام PBS ، أضف 5 ملليلتر من 0.25٪ تريبسين-EDTA ، واحتضن الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.

ثم أضف 4 ملليلتر من وسائط OP9 ، واربط طبقة الخلية عن طريق سحب العينات لعمل تعليق أحادي الخلية. انقل معلق الخلية إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر من خلال مصفاة 100 ميكرومتر ، وقم بالطرد المركزي للأنبوب عند 300 مرة جم و 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. استنشق المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في 10 ملليلتر من وسائط OP9.

ضع تعليق الخلية على طبق ثقافة خلية جيلاتيني جديد بطول 10 سم ، واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة. بعد ذلك، اجمع أي خلايا غير ملتصقة عن طريق سحب العينة اللطيف. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر من خلال مصفاة ، وجهاز طرد مركزي كما هو موضح سابقا. ثم ، قم بشفط المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في 10 ملليلتر من وسائط التمايز.

ضع تعليق الخلية على طبق متقارب جديد OP9-delta-1. قم بالمرور على الزنازين في اليوم 16 وفقا لتوجيهات المخطوطة ، واستمر في المرور عبر الخلايا غير الملتصقة كل خمسة إلى سبعة أيام بعد ذلك. بعد 35 يوما من التمايز ، قم بإثراء مجموعة الخلايا الإيجابية CD4 عن طريق عزل حبة CD4 المغناطيسية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.

بعد ذلك ، أعد تعليق الخلايا في وسائط OP9 ولوحة 1 مليلتر من تعليق الخلية في كل بئر من صفيحة مسطحة القاع 24 بئرا لزراعة الأنسجة من OP9-delta-1 المتقاربة. تحفيز الخلايا عن طريق إضافة 100 وحدة دولية من IL-2 البشري ، و 5 نانوغرام من IL-7 البشري ، و 500 نانوجرام من الجسم المضاد CD3 المضاد للإنسان ، و 2 ميكروغرام من الجسم المضاد CD28 المضاد للإنسان لكل بئر. بعد أربعة إلى سبعة أيام ، يمكن جمع الخلايا لمزيد من التحليل.