إزالة الخلايا الدبقية الصغيرة بشكل انتقائي من ثقافة الخلايا العصبية الحبيبية المخيخية للفئران

خذ مخيخ الفئران المحصود وقطعه إلى شظايا.

انقل الشظايا إلى أنبوب يحتوي على التربسين واحتضنها.

يهضم التربسين المصفوفة خارج الخلية للأنسجة ، مما يؤدي إلى فك الخلايا العصبية الحبيبية المخيخية ، وكذلك الخلايا غير العصبية مثل الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا النجمية.

أضف مخزن مؤقت يحتوي على مثبط التربسين و DNase. يقوم المثبط بتعطيل التربسين بينما يحلل DNase الحمض النووي الملوث.

جهاز الطرد المركزي والتخلص من المادة الطافية.

أعد تعليق الأنسجة في مخزن مؤقت يحتوي على المثبط و DNase ، وفصله ميكانيكيا لتشكيل معلق أحادي الخلية.

تراكب المعلق على محلول عازل يحتوي على البروتين.

جهاز الطرد المركزي والتخلص من المادة الطافية التي تحتوي على الحطام الخلوي.

أعد تعليق الخلايا في الوسائط وبذرها على أغطية مطلية ببولي إل ليسين لتسهيل الارتباط الخلوي.

قم بإزالة الوسائط. اغسل الخلايا بوسائط جديدة ، ثم أضف وسائط تحتوي على مثبط دورة الخلية لمنع تكاثر الخلايا الدبقية.

استبدل نصف الوسائط بوسائط جديدة تحتوي على مثبط لليزوزوم.

يستهدف المثبط بشكل انتقائي الخلايا الدبقية الصغيرة ويعطل الأغشية الليزوزومية ، مما يتسبب في موت الخلايا الدبقية الصغيرة وإزالتها من المزرعة.

ابدأ هذا الإجراء عن طريق جمع المخيخ من صغار الفئران البالغة من العمر أربعة إلى سبعة أيام. ضعها على الفور في طبق بتري يحتوي على خمسة ملليلتر من المحلول أ على الثلج. ثم قم بإزالة المحلول الزائد من المخيخ وضع الأنسجة في غطاء طبق بتري. بعد ذلك ، قم بتقطيع الأنسجة جيدا بشفرة حلاقة ملتهبة جيدا في ثلاثة اتجاهات مختلفة على الأقل.

بعد ذلك ، أضف المنديل المفروم إلى المحلول ب. ضعه في حمام مائي على حرارة 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق ، ورجه برفق كل دقيقتين. ثم أضف 20 مل من المحلول D إلى الأنبوب لتحييد التربسين. رج العبوة وأجهزة الطرد المركزي على حرارة 65 جم لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، اسكب المادة الطافية. أعد تعليقه في أربعة ملليلتر من المحلول C.

قم بترتيث العينة 10 مرات مع كل من الماصات الزجاجية الملتهبة الثلاث ذات القطر المتناقص حتى يصبح التعليق متجانسا قدر الإمكان. بعد ذلك ، أضف بضع قطرات من هذا المتجانس ببطء وبرفق فوق BSA-EBSS. إذا بدأ في الغرق من خلال BSA-EBSS ، فقم بترتيتر أكثر وأضف المزيد من الحل C. يجب أن يجلس المتجانس في طبقة أعلى BSA-EBSS.

قم بتدويرها على حرارة 100 غرام لمدة خمس دقائق ، ولا تهتز. ثم, قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الحبيبات في ملليلتر واحد من وسط MEM. عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم ، وقم بوضعها في 800,000 خلية لكل غطاء في 500 ميكرولتر من وسط MEM. بعد ذلك ، ضعها في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 6٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد ذلك ، قم بعمل محلول من وسط MEM يحتوي على 10 ميكرومولار من مثبط دورة الخلية ، AraC.

لكل غطاء ، احتفظ ب 250 ميكرولترا من الوسط القديم في طبق جديد مكون من 24 بئرا واستنشق الباقي. أضف 250 ميكرولتر من وسط MEM العادي لغسل الخلايا. بعد ذلك ، أضف 250 ميكرولترا من الوسط القديم مرة أخرى إلى الخلايا ، وقم بتعبئتها ب 250 ميكرولترا من الوسط المحتوي على AraC.

في هذا الإجراء ، أضف LME النقي إلى خمسة ملليلتر من وسط MEM لإعطاء تركيز نهائي يبلغ 150 ملليمولار LME. أعد المحلول إلى درجة الحموضة 7.4 باستخدام محلول الحمض القاعدي. بعد ذلك ، قم بتصفيته المعقمة باستخدام PES مقاس 28 ملم مع مرشح حقنة 0.2 ميكرومتر.

بعد ذلك ، قم بتخفيف محلول LME إلى تركيز 50 مللي مولار في وسط MEM. ثم ضعه في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، جنبا إلى جنب مع وسط MEM العادي لثقافات التحكم. بعد 10 دقائق ، قم بإزالة 250 ميكرولتر من وسط MEM من كل ثقافة CGC. بعد ذلك ، احتفظ بالوسائط عند 37 درجة مئوية.

بعد ذلك ، عالج الخلايا بوسط MEM الذي يحتوي على مرتين من LME أو بوسط MEM مسخن مسبقا بدون LME لثقافات التحكم. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في جو مرطب مع 6٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك ، اغسل الخلايا مرتين في وسط MEM جديد مسخن مسبقا لإزالة الوسائط المحتوية على بورصة لندن للمعادن.

بعد ذلك ، استبدل وسط الاستزراع المحتفظ به بكمية متساوية من وسط MEM الطازج الدافئ مسبقا. أخيرا ، احتضان المزارع في ثاني أكسيد الكربون المرطب بنسبة 6٪ عند 37 درجة مئوية.