أخذ البصمات من الحمض النووي المتفطرة الجذامية سلالات باستخدام متغير كرر جنبا الى جنب رقم (VNTR) -- تحليل قطعة الطول (FLA)

الهدف العام من هذا الإجراء هو تطوير بصمة DNA مميزة لبكتيريا mycobacterium lere، وهي البكتيريا غير القابلة للاستزراع والمسببة للجذام، وذلك مباشرة من العينات السريرية. يتم تضخيم DNA بكتيريا M lri المستخلص من خزعات المرضى بواسطة تقنية multiplex PCR باستخدام بادئات فلورية متخصصة في مواقع التكرارات الترادفية ذات العدد المتغير أو VNTR. وبمجرد تضخيم DNA، يتم إجراء الفصل الكهربائي الشعيري لتحليل طول الشظايا.

يتم تحليل البيانات لتحديد عدد قطع الحمض النووي ذات التكرارات الترادفية القصيرة في كل موقع جيني. وبما أن السلالات المختلفة من EPRI تظهر أعداداً مختلفة من التكرارات الترادفية في كل موقع، فإن البيانات المستمدة من مواقع متعددة تنتج بصمات DNA فريدة، ويمكن من خلال هذه التقنية إنشاء قاعدة بيانات لأنواع السلالات لدى المرضى.

يمكن توصيف بنية المجتمع وتطور وانتقال الجذام بين المرضى في مجتمعات محددة وعبر العالم، مما يوفر في نهاية المطاف أدوات وأدلة جينية للقضاء على الجذام. يمكن استخدام هذه الطريقة لتتبع انتشار الجذام، وتحديد بؤر الإصابات الحديثة والأفراد المعرضين للخطر، ولقياس فعالية البرامج الموجهة. سيقوم بتوضيح الإجراء كل من لي ورون جينسين، الباحثان من مختبري، وجيسون ريفرز من مرفق الأجهزة المركزي لدينا، لاستخلاص DNA من خزعات سريرية باستخدام مجموعة استخلاص KaiGen DNA القياسية.

بمجرد الحصول على DNA، قم بتجهيز منطقة عمل جديدة داخل كابينة PCR نظيفة. ولتجنب أي تلوث بـ DNA، امسح الكابينة ومجموعة الماصات باستخدام ethanol بتركيز 70% وعرض الكابينة والماصات للأشعة فوق البنفسجية (UV) لمدة 15 دقيقة. وبمجرد تنظيف الكابينة، يمكن البدء في تجهيز multiplex PCR، حيث يتم استخدام من أربعة إلى خمسة أزواج من البادئات (primer pairs) لكل multiplex PCR، ويكون أحد البادئات في كل زوج موسوماً بفلورة.

يجب خلطها. استخدم مخزونات البادئات بتركيز 10 micromolar المحضرة في محلول TE buffer لصنع خلطات البادئات؛ اخلط كميات متساوية من جميع البادئات الأمامية أو العليا في أنبوب واحد لتحقيق تركيز نهائي قدره 2 micromolar. أضف محلول TE buffer لكل بادئة إذا لزم الأمر.

في أنبوب "إينور" (einor) آخر، اخلط جميع البادئات العكسية أو السفلية بنفس الطريقة. وبمجرد تحضير مخاليط البادئات، قم بتحضير مزيج PCR MES. ثم صمم خريطة للصفيحة (plate map) تتضمن جميع العينات والضوابط الخاصة بكل عينة.

يجب أن يحتوي المزيج الرئيسي على 12 µL من KaiGen multiplex PCR mix، و2 µL من كل مجموعة بادئات، و2 µL من Q solution. تأكد من تحضير كمية كافية من المزيج الرئيسي لتشمل الضوابط ولتعويض الفاقد أثناء عملية الماصة. قم بطرد المزيج الرئيسي مركزياً لفترة وجيزة.

بعد ذلك، قم بتوزيع 18 µL من المزيج الرئيسي (master mix) في كل بئر من آبار لوحة PCR. ولتجنب تلوث عينات DNA، قم بتغيير القفازات، ومسح وتعقيم كابينة سلامة بيولوجية منفصلة. وكما سبق، بمجرد تعقيم غطاء الكابينة، انقل اللوحة إلى تلك الكابينة.

ثم أضف 2 µL من عينة DNA إلى كل بئر يحتوي على المزيج الرئيسي (master mix). تأكد من استخدام رؤوس ماصات مانعة للرذاذ لتجنب التلوث الخلطي. أغلق ألواح PCR بعناية وقم بطردها مركزياً لفترة وجيزة لخلط المحتويات.

بعد ذلك، ضع صفيحة التفاعل في جهاز التدوير الحراري وباشر برنامج PCR الخاص بتقديم العينات. بالنسبة لتحليل الطول القطعي (FLA)، قم بتحضير محلول الفورماميد، والمزيج الرئيسي (master mix)، وأضف نواتج PCR المخففة في أنبوبينور نظيفين، مع دمج 12 µL من محلول الفورماميد عالي التركيز و 0.3 µL من معيار تحديد الحجم GeneScan 500 C DNA لكل عينة سيتم اختبارها. ثم وزع 12.3 µL من هذا المحلول في كل بئر من آبار صفيحة تفاعل ذات جودة بصرية مكونة من 96 بئرًا.

بمجرد اكتمال تفاعل PCR، يتم وضع اللوح في جهاز الطرد المركزي. تأكد من تسجيل موضع كل عينة في مخطط اللوح. بعد ذلك، وفي لوح منفصل مكون من 96 بئراً، قم بتوزيع 59 µL من الماء الخالي من النوكلياز في كل بئر، وأضف 1 µL من كل تفاعل PCR إلى كل بئر لتخفيف الحمض النووي المـُضخم بنسبة 1 إلى 60.

بمجرد تخفيف الحمض النووي DNA، استخدم ماصة متعددة القنوات لنقل ميكرولتر واحد من كل عينة PCR مخففة إلى البئر المقابل في اللوح الذي يحتوي على محلول form amide السائب. بمجرد اكتمال البرنامج، يمكن اختبار العينات عن طريق الفصل الكهربائي لهلام الأجاروز القياسي للتأكد من تضخيم قطع DNA بالأحجام المتوقعة في هذه المرحلة. يتم تحضير العينات للتحليل بواسطة الفصل الكهربائي الشعري الفلوري باستخدام محلل جيني FLA؛ وقبل التحليل، أضف سدادة (septum) إلى اللوح وقم بالطرد المركزي لفترة وجيزة لإزالة فقاعات الهواء ودفع العينة إلى أسفل البئر.

سيعمل محلول IDE على تغيير الطبيعة الكيميائية للسلاسل، لذا لا توجد حاجة لإجراء مسخ حراري. ضع اللوحة في صينية التحميل. قم بتقييم ناتج PCR المسمى باستخدام الفصل الكهربائي الشعيري، مثل جهاز التحليل الجيني ABBI'S genetic analyzer 31 30 xl.

قم بتحليل العينات باستخدام شعيرية بطول 50 centimeter مملوءة بـ pop seven polymer كوسط فصل. ينتقل DNA نحو نهاية الشعيرية حيث يقوم الليزر والكاشف بقياس الوسوم الفلورية؛ افتح برنامج الجمع الخاص بالمحلل. سيحتاج المحلل إلى المعايرة للكشف عن جميع الأصباغ المستخدمة قبل تشغيل العينات، بما في ذلك معيار الحجم؛ مجموعة dset المستخدمة لهذه العينات هي ABIs G five Dissect. يتم حقن عينات dset عن طريق الحقن الكهربائي الحركي بجهد 1.6 kilovolts لمدة 15 seconds.

افصل الشظايا بتطبيق 15 kilovolts لمدة 1800 seconds. يبلغ إجمالي وقت التشغيل لكل دورة حوالي 45 minutes. وبمجرد انتهاء التشغيل، قم بإنشاء ملفات بيانات لكل عينة.

يتم وضع الملفات في مجلد خاص باللوحة بواسطة برنامج تجميع المحلل في موقع محدد مسبقاً. وتكون الملفات بتنسيق FSA. ويمكن تحليل بيانات FLA باستخدام برنامج peak scanner، المتوفر مجاناً على الموقع الإلكتروني لشركة Applied Biosystems.

لتحليل البيانات، انقر فوق "بدء مشروع جديد"، ثم "إضافة ملفات". قم بتحميل ملفات البيانات المختارة إلى البرنامج، بما في ذلك ضوابط التحكم الموجبة والسالبة. اختر الملفات التي تم تحميلها وقم بتحليلها.

يتم تمثيل النتائج على شكل مخطط كروماتوغرافي لـ FLA. تظهر معايير القياس كقمم برتقالية، بينما تمثل القمم الملونة عينات الحمض النووي البكتيري لكل موقع تم تحليله في العينة؛ انقر فوق القمة لتحديد حجم أزواج القواعد الخاصة بها. وبسبب تخليق انزلاق السلسلة بواسطة إنزيم DNA polymerase، سيتم اكتشاف مجموعة من القمم من نفس اللون لبعض مواقع الساتل الميكروي.

في هذه الحالات، تكون القمة المختارة عادةً هي ذات السعة الأكبر. قارن أحجام الشظايا في كل عينة بحجم الضابط الموجب لتحديد عدد قطع التكرارات المترادفة الموجودة لكل أليل تم اختباره، وسجل البيانات في جدول بيانات Excel لإجراء مزيد من التحليل. يوضح هذا الشكل البصمة الوراثية للحمض النووي DNA لعزلات من سبعة مرضى ينتمون إلى ثلاث عائلات مختلفة من القرية نفسها، كما يُشار إلى عدد التكرارات المترادفة لكل موقع متعدد الأشكال تم تحليله.

تشير هذه البيانات إلى أن فردين من العائلة be مصابان بنفس السلالة، بينما أصيب فرد واحد بسلالة مختلفة. ومن المرجح أن يكون أفراد العائلات C مصابين بنفس السلالة، وكذلك أفراد العائلة A. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تضمين تفاعل البوليميراز المتسلسل المتعدد (multiplex PCR) وتحليل طول القطع بشكل روتيني للحصول على بصمات V-N-T-R-D-N-A لمرضى الجذام المراجعين للعيادات.

تمثل هذه الأدوات الجزيئية المبتكرة مكملات لعلم الأوبئة التقليدي من أجل مكافحة مرض الجذام.