عزل الخلايا واستزراعها من الورم الدبقي البنطي الجوهري المنتشر

ابدأ بشظايا أنسجة جذع الدماغ التي تحتوي على الورم الدبقي الجسري الجوهري المنتشر ، وهو ورم مشتق من الخلايا السلفية الدبقية في بيئة غنية بالأعصاب النخاعي.

عالج بالإنزيمات المحللة للبروتين لتحلل المصفوفة خارج الخلية للنسجة.

بعد الحضانة ، قم بعمل ماصة المحتويات بشكل متكرر لتسهيل تفكك الخلايا وتدهور غمد المايلين.

تصفية وأجهزة الطرد المركزي لجمع الخلايا. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليقها في عازلة باردة.

أضف محلول السكروز لفصل تدرج الكثافة واخلطه جيدا.

بعد ذلك ، جهاز الطرد المركزي لفصل الخلايا الأثقل عن حطام المايلين الأخف.

قم بإزالة طبقة المايلين وأضف المخزن المؤقت لتحلل كرات الدم الحمراء.

أضف عازلة باردة لإيقاف عمل التحلل. جهاز الطرد المركزي وإزالة المادة الطافية للتخلص من كرات الدم الحمراء المحللة.

أعد تعليق الخلايا في وسط عصبي قاعدي دافئ وزرعها في قارورة غير مغلفة.

يؤدي عدم وجود عوامل عصبية إلى موت الخلايا العصبية ، بينما تستخدم الخلايا السلفية الدبقية العناصر الغذائية وعوامل النمو ، مما يؤدي إلى الانتشار. أضف وسيطا جديدا للحفاظ على مستويات عامل النمو.

بمرور الوقت ، تتجمع هذه الخلايا تلقائيا في مجموعات الخلايا ، وتشكل مجالات عصبية عائمة بحرية.

في هذا الإجراء ، قم بالطرد المركزي للأنبوب المخروطي الذي يحتوي على شظايا الأنسجة المتبقية لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، قم بإزالة المادة الطافية وأضف محلول الهضم الأنزيمي الدافئ مسبقا بحيث يكون هناك 5 مل من محلول الهضم لكل 1 مليلتر من الأنسجة. بعد ذلك ، أغلق غطاء الأنبوب المخروطي بغشاء مختبري واحتضان التفاعل على دوار عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

بعد الحضانة ، قم بتقطيع العينات برفق. باستخدام ماصة مصلية سعة 10 ملليلتر، قم بتحريك العينة لأعلى ولأسفل لمدة 6 إلى 8 مرات وتجنب توليد فقاعات هواء زائدة. بعد ذلك، أضف طرف ماصة سعة 1000 ميكرولتر إلى نهاية الماصة وقم بترتيتر العينة لمدة 6 إلى 8 مرات إضافية.

اسمح لأي قطع متبقية بالاستقرار في قاع الأنبوب. بعد ذلك ، قم بإزالة وتصفية المادة الطافية مع الخلية التي لا تزال معلقة من خلال مرشح 100 ميكرون في أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مليلتر يسمى التفكك الأنزيمي ، وقم بتخزينه على الجليد. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي لأنبوب التفكك الأنزيمي لمدة خمس دقائق واستمر في الطرد المركزي المتدرج للسكروز. إذا كانت العينة لا تزال معلقة في المحلول ، فقم بالطرد المركزي لمدة خمس دقائق.

بعد ذلك ، قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الأنسجة في 20 مل من HBSS الباردة بدون الكالسيوم والمغنيسيوم. ثم ارفع الحجم إلى 25 مل مع HBSS البارد. ببطء ، أضف 25 مل من محلول السكروز المولي 1.8 واقلب الأنبوب للخلط. ينتج عن هذا تدرج سكروز 0.9 مولار.

بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للعينة دون انقطاع لمدة 10 دقائق. استنشق بعناية بقايا المايلين وأكبر قدر ممكن من محلول السكروز. ثم اغسل العينة بإضافة 30 مل من HBSS البارد بدون الكالسيوم والمغنيسيوم ، والخلط برفق. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي لمدة خمس دقائق.

في هذا الإجراء ، قم بإزالة المادة الطافية للغسيل. أضف 5 ملليلتر من المخزن المؤقت لتحلل ACK وأعد تعليق حبيبات الخلية برفق ، وقم بتدوير الأنبوب لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة. ثم قم بإخماد التحلل بإضافة 30 مل من HBSS البارد بدون الكالسيوم والمغنيسيوم.

بعد ذلك ، قم بجهاز الطرد المركزي لمدة خمس دقائق. أعد تعليق حبيبات الخلية النهائية في 10 إلى 15 مل من TSM الكامل الدافئ مع عوامل النمو ، وحدد كثافة الخلية القابلة للحياة على مقياس كثافة الدم باستخدام استبعاد التريبان الأزرق. بعد ذلك ، انقل تعليق الخلية النهائي إلى قارورة ثقافة T75 جديدة. إضافة عوامل نمو إضافية كل يومين للحفاظ على مستويات عامل النمو الإجمالية ومراقبة لتطوير الخلايا العصبية السرطانية.