Microfabricated بعد صفيف ، للكشف عن (mPADs) : نهج لعزل القوات الميكانيكية

مرحبا ، أنا ناثان سنيا ديكي ومني اليوم ويس ليجان وروبي ديساي ومايك يانغ. ونحن من مختبر كريس تشين هنا في جامعة بنسلفانيا. في هذا الفيديو ، سنقدم نهجنا لقياس قوى الجذب الخلوي باستخدام مجموعة صغيرة من المنشورات.

تتولد قوى الجر من خلال تفاعلات الميوسين والأكتون وتلعب دورا مهما في علم وظائف الأعضاء لدينا. أثناء التطور ، فإنها تمكن الخلايا من الانتقال من مكان إلى آخر من أجل تشكيل الهياكل المبكرة لأنسجتنا. كما أنها تساعد في عملية الشفاء لأنها ضرورية لإغلاق الجروح أو هجرة الكريات البيض وزحفها عبر أجسامنا.

لكن لسوء الحظ ، يمكن أن تكون هذه القوى نفسها ضارة بصحتنا في حالة ورم خبيث من السرطان أو نمو الأوعية الدموية نحو الورم. لذلك هناك عدد قليل جدا من الطرق التي يمكن للمرء أن يقيس فعليا قوى الجر هذه بطريقة كمية ، وخاصة على المستوى الجزئي والنانوي للخلايا الفردية. كانت معظم الطرق الشائعة لدراسة الخلايا في المختبر مع أطباق ذات قاع زجاجي أو أطباق البوليسترين ، لكنها ركائز صلبة للغاية وهي ليست كذلك ، فهي لا تسمح لنا بقياس قوى الجر والتشهير الذي تسببه الخلية جسديا.

ولذا كان من الصعب جدا فهم الآليات الأساسية لقوى الجر دون نوع من القراءة المادية. وهكذا في مختبر كريس تشين لدينا تقنية تسمح لنا بالتغلب على هذه القيود. تعتمد طريقتنا على مجموعة رأسية من الكاتيل المرنة ، حيث يكون مقياس الصلابة والحجم بحيث تنتشر الخلايا الفردية عبر ناتئ متعددة وتحرفها في هذه العملية.

الأبعاد التي نستخدمها في أغلب الأحيان هي ثلاثة ميكرون في القطر ، وأعمدة أسطوانية قطرها ، وطولها 10 ميكرون مع مركز تسعة ميكرون لتباعد المركز ومجموعة مستطيلة. ومع ذلك ، يمكن أن تتنوع هذه الأبعاد لاستيعاب مجموعة متنوعة من الدراسات الخلوية. نبدأ بسيد السيليكون الصلب الذي يمكنك رؤيته هنا ثم ترجمته إلى ناتئ PDMS مرن نراه هنا.

باستخدام هذه التقنية ، يمكننا قياس انحرافات الكابولي الفردية تحت المجهر والتراجع عن قوى الجر الخلوية بالحجم والاتجاه المطلوبين لتوليد مثل هذه الانحرافات. لقد قمنا بتحويل هذه الركائز M وسادات لكاشفات المصفوفة الدقيقة ، وفي هذا الفيديو سنوضح لك كيفية تصنيع وسادات M ، بدءا من سيد السيليكون من خلال النسخ المتماثل PDMS ، وأخيرا إلى حساب التعديل والانكماش الخلوي. مرحبا ، ها نحن في غرفة مختبراتنا النظيفة.

هذه غرفة خالية من الغبار وحساسة للضوء تسمح لنا بجعل SU ثمانية أعمدة ستكون بمثابة سيد السيليكون. سنبدأ أولا برقائق السيليكون وبهذا سنغطيها ب SU ثمانية مقاومة للصور SU ثمانية مقاومة سلبية وحساسة للضوء. لذلك عندما نسلط الضوء من خلال قناع الصورة هذا ، فإنه سيؤدي إلى ظهور الضوء في المنشورات الدقيقة ثم تشكيل هيكل ثلاثي الأبعاد ، والذي سيكون بعد ذلك وظائف SU الثمانية التي نلقيها بعد ذلك في PDMS.

لذلك بعد الانتهاء من جميع معالجتنا ، ستبدو الرقاقة هكذا ، حيث لدينا العمود الصغير ، هياكل الأعمدة الدقيقة المصنعة بالفعل في الرقاقة. لذلك لجعل الأساتذة ، نبدأ أولا برقائق السيليكون العارية وقد تم تنظيفها بمعالجة الأوزون لمدة سبع دقائق وقمنا أيضا بتجفيف هذه الرقاقة لمدة 30 دقيقة عند 120 درجة مئوية. سنقوم بتدوير SU ثمانية 2002 على هذا لتشكيل طبقة أساسية رفيعة جدا للمشاركات.

لأننا سنقوم بتدوير SU ثمانية ، سأرتدي قناعا واقيا من الغاز ، وأعيد تحميل الرقاقة في هذا الحامل هنا ، ونفض الغبار عن أي غبار قد يكون هناك ، ونضعه على الدوار ، وسنتحقق للتأكد من أنه في المنتصف وبعد ذلك سننتقل إلى صب SU eight 2002 فوق هذا. وبعد ذلك سنمضي قدما وندور الرقاقة. ثم نضعها على الطبق الساخن ، الخبز الناعم.

نفعل هذا لمدة دقيقة واحدة بعد ذلك. ثم نأخذها وننقلها إلى لوح ساخن بزاوية 95 درجة. ونقوم بذلك لمدة دقيقتين.

وعند الانتهاء ، سنأخذ هذا الآن وننطلق للقيام بالتعرض للفيضانات في تقويم القناع. حسنا ، لقد قمنا للتو بتدوير SU ثمانية ، الطبقة الأولى من SU ثمانية على هذه الرقاقة ، والآن نحتاج إلى تعريض الرقاقة بأكملها لإنشاء الطبقة الأساسية الأولى للأعمدة الصغيرة. إذن، علينا أن نعطي هذا 70 مللي جول من التعرض.

إذن، نحتاج بعد ذلك إلى قياس شدة الضوء الفعلية في تقويم القناع هنا. لذلك نقوم بتحميل العداد في الوزن في تقويم القناع. ثم نعرضها بالضوء.

هذا هو ضوء الأشعة فوق البنفسجية هنا. نقوم بتحميل رقاقة السيليكون على تقويم القناع ، ونضعها في تقويم القناع. وليس لدينا قناع هذه المرة ، وبهذه الطريقة يمكننا فضح الفيلم بأكمله.

دعنا نضع الغالق ودعنا نمضي قدما ونطلب دقيقة واحدة من التعريض الضوئي وسنمضي قدما ونكشف. لذلك بعد دقيقة واحدة من الانتهاء من النظام ، يمكننا بعد ذلك إخراج الرقاقة. والآن نحتاج إلى القيام بخبز ما بعد التعرض.

لقد كشفنا للتو عن هذه الرقاقة وسنضيف الآن حرارة لإحداث تفاعل الربط المتقاطع لهذه الطبقة الأولى من SU eight. لذلك نضعها على لوح ساخن بدرجة حرارة 65 درجة لمدة دقيقة واحدة ثم ننقلها إلى لوح ساخن بدرجة حرارة 95 درجة لمدة دقيقتين. بعد عملية الدقيقتين ، نقوم بعد ذلك بإيقاف تشغيل اللوح الساخن والسماح للرقاقة بالتبريد مرة أخرى إلى درجة حرارة الغرفة ، والتي تستغرق حوالي 30 دقيقة.

إذن، قمنا بتدوير الطبقة الثانية من SU ثمانية على هذه الرقاقة. والآن نحتاج إلى فضح هذا بالفعل من خلال قناع الصورة. هذه المرة سنستخدم مرشح الأشعة فوق البنفسجية لحجب ضوء الأشعة فوق البنفسجية العميق.

هذا زجاج بصري من هويا يمكنك الحصول عليه ، لكن هذه المرة نحتاج إلى قياس الكثافة مرة أخرى. لذلك سنستخدم مقياس الضوء الخاص بنا أو سنستخدم المرشح الموجود في الأعلى لقياس الشدة التي تمت تصفيتها. وبعد ذلك سنقوم بتحميل القناع في تقويم القناع.

ينتج هذا المفتاح فراغا يثبت القناع في مكانه. سنقوم بعد ذلك بوضعه في تقويم القناع. سنقوم بعد ذلك بوضع الفلتر في الأعلى ثم نقوم بتحميل الرقاقة الخاصة بنا.

نريد التأكد من وجود اتصال جيد ، لذلك نرفعه عند الاتصال ثم نبدأ بعد ذلك في التعرض بعد التعرض ، سنقوم بإخراج الرقاقة من تقويم القناع. لذلك لدينا الآن مناطق تم تعرضها بشكل انتقائي. سنأخذ هذا إلى الفرن ، إلى الأطباق الساخنة للقيام بالخبز بعد التعرض عليه.

لقد انتهينا للتو من The po ، الخبز النهائي بعد التعريض الضوئي ، والآن سنقوم بتطوير هذه الرقاقة حتى نتمكن من الحصول على الهياكل ثلاثية الأبعاد. ما سنفعله هو أننا سنغسل هذا ، ونطور هذا في P-G-M-E-A ، والذي سيغسل SU ثمانية غير المكشوفة. لذلك نبدأ أولا في طبق واحد من P-G-M-E-A ونجلس الرقاقة هنا لمدة دقيقتين مع تحريض خفيف.

لذلك سأترك هذا لمدة دقيقتين. لذلك سننتقل إلى طبق ثان من P-G-M-E-A. سيؤدي ذلك إلى إزالة P-G-M-E-A المشبع مع SU ثمانية.

بعد 10 ثوان سنأتي به إلى IPA. هذا يغسل P-G-M-E-A. نضعها هنا لمدة 20 ثانية ، مرة أخرى مع بعض الإثارة الخفيفة.

وبعد ذلك الآن لدينا هياكل المراكز القائمة بذاتها. لذلك سنضع هذا في الهكسان، الذي له توتر سطحي منخفض. سنغسل لمدة خمس ثوان في هكسان، ثم سنجهز لتجفيفها.

لقد قمنا للتو بتطوير الرقاقة والآن سنضعها على صفيحة ساخنة ونرفع درجة الحرارة ببطء إلى 1 50. وما يحدث هو أن درجة الحرارة المرتفعة تتقاطع مع SU ثمانية لجعلها أكثر صلابة من الناحية الهيكلية ونتركها على هذه الصفيحة الساخنة طوال الليل. لذلك في أي مكان من 14 إلى 20 ساعة وبعد ذلك سنقوم بإيقاف تشغيل اللوح الساخن والسماح له بالتبريد مرة أخرى إلى درجة حرارة الغرفة مرة أخرى.

لذا ما نحتاج إلى القيام به هو أننا سنقوم بتقطيع هذه الرقاقة إلى حجم أصغر. نريد بشكل أساسي قطع رقاقة السيليكون هذه وإنشاء شريحة صغيرة من هذا النمط الداخلي فقط هنا. وسيبدو مثل هذا الهيكل هناك حيث سيستخدمون الإيبوكسي.

وسنقوم بلصق هذه الشريحة على شريحة زجاجية مثل هذه. وهذا يوفر دعما هيكليا. لذا لتقطيع الرقاقة ، إنه نوع من الفن ، ولكن ما يمكنك فعله هو أنك تستخدم بشكل أساسي كاتبا ماسيا وتبدأ من حافة واحدة فقط.

وبسبب المستويات البلورية ، قمت فقط بوضع شق صغير الآن أدى إلى حدوث كسر ، والذي يمكنني بعد ذلك النقر عليه باستخدام هذه الأداة ، يمكننا تقشير هذا بعيدا ويمكننا بعد ذلك القيام بالمزيد من التخفيضات هنا حتى نحصل على هيكل صغير مثل هذا. ثم تضع شريحة السيليكون بسرعة الآن على الزجاج وتثبيتها في مكانها. وتركت ذلك يجلس.

وهكذا بعد الانتهاء ، سيكون لديك جهاز مشابه لهذا. لذلك قمنا بتركيب سيد السيليكون على هذه الشريحة الزجاجية والآن سنعطيها طبقة من الفلوي ، مما سيساعد في إطلاق هذا الهيكل من PDMS لاحقا. إذن سنضع الشريحة في هذا المجفف ثم نأخذ بضع قطرات من هذا الكلورو سيلينغ الثلاثي بضع قطرات في المجفف.

نقوم بذلك داخل غطاء المحرك لأن هذا يحتوي على منتج ثانوي لغاز الهيدروكلوريك المائي ، وهو قاسي جدا. انطلق وأغلق الغطاء ، وقم بتوصيل هذا بالمكنسة الكهربائية ثم نمضي قدما ونترك هذا يجلس من المكنسة الكهربائية ونترك هذا الإيداع طوال الليل للحصول على طلاء لطيف على رقاقة السيليكون بأكملها. مرحبا ، أنا ويسلي ليجان.

أنا طالب دراسات عليا في مختبر كريستوفر تشين. في هذه المرحلة ، أوضح لك نيت كيفية إنشاء سيد سيليكون لركائز الضعف الجنسي الخاصة بنا. ومع ذلك ، قبل أن نتمكن من استخدام هذه الأداة لقياس الانقباض الخلوي ، من الضروري أولا تكرار هياكل الصور الصلبة باستخدام بوليمر سيليكون مرن.

مهمتنا الأولى هي إنشاء قالب سلبي لسيد السيليكون الذي قمنا بتصنيعه سابقا. نقوم بذلك باستخدام مطاط صناعي من السيليكون يسمى PDMS أو بولي ميثيل سلون إلى بوليمر PDMS الخاص بنا. نضيف الآن نسبة واحد إلى 10 من عامل المعالجة.

بمجرد أن نزن المحلول ، من الضروري خلط بوليمر PDMS وعامل التسرب المتقاطع جيدا. من الواضح أن هذا الخلط يدخل الكثير من فقاعات الهواء في حلنا. لذلك في هذه المرحلة ، من الضروري تغطيته وتفريغه في المجفف الفراغي.

بمجرد أن يتم تفريغ PDMS بالكامل وارتفاع جميع الفقاعات إلى السطح وفرقعتها ، يمكننا إزالتها من المجفف الفراغي. يمكننا الآن استخدام هذا المزيج من PDMS وعامل الربط المتقاطع لإنشاء قالب سلبي لسيد السيليكون لدينا. وللقيام بذلك ، نستخدم علبة فطيرة ونضع سيد السيليكون المركب في وسطه.

ثم نسكب بعناية محلول بوليمر DGAs في الطبق فوق الجزء العلوي من رقاقة السيليكون في محاولة لمنع تكون أي فقاعات إضافية. عادة ما نحاول صب البوليمر بسمك ربع بوصة تقريبا. يمكنك أن ترى أن هذه العملية تدخل حتما بعض فقاعات الهواء في الخليط.

حتى الآن نضع هذا الطبق جانبا لمدة 30 دقيقة تقريبا للسماح للفقاعات بالارتفاع إلى السطح والانفجار. يمكننا أن نرى أنه بعد تركه يجلس ، لا يزال هناك عدد قليل من فقاعات الهواء على سطح PDMS. ومع ذلك، نظرا لوجود هذه الفقاعات الموجودة على السطح العلوي، يمكننا الآن استخدام دفعة سريعة من النيتروجين لتفجير أي فقاعات متبقية.

من أجل الربط المتبادل الكامل بين حل PDMS و CROSSLINKER وإنشاء قالب سلبي صلب لسيد السيليكون الخاص بنا ، نقوم بخبزه عند 110 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. يمكننا أن نرى أن هناك طبقة رقيقة من PDMS أعلى ركيزة السيليكون. وقبل أن نتمكن من تقشير الاثنين ، من الضروري أولا قطع هذه الطبقة.

ثم يمكننا تطعيم هذه الطبقة العليا وتقشيرها برفق بعيدا عن ركيزة السيليكون. في هذه المرحلة ، يمكننا عكس ركيزة السيليكون السلبية وتقشيرها ببطء شديد ، وهي ركيزة PDMS السلبية بعيدا عن سيد السيليكون. حسنا ، نقوم بذلك عن طريق الضغط على أحد طرفيه لأسفل وتقشير ركيزة PDMS برفق.

يمكنك رؤية التقدم الأمامي حيث تتقشر الركيزة بعيدا عن سيد السيليكون. الآن بعد أن أنشأنا قالبا سلبيا A-P-D-M-S لسيد السيليكون الخاص بنا ، يمكننا تقطيعه إلى أربعة قوالب سالبة فردية لعمل ركائز الوسادة النهائية. من المهم في هذه المرحلة عدم لمس الجزء العلوي من الركيزة السالبة بالملقط أو القفازات لتجنب إتلاف السطح.

إذن، في هذه المرحلة، أنشأنا أربعة قوالب سالبة فردية من سيد السيليكون تتكون من ثلاثة آبار قطرها ميكرون، بعمق تسعة ميكرون. من أجل تجديد الأسطح الكابولية المرتفعة ، يمكننا أن نلقي مرة أخرى على هذه القوالب السلبية من PDI PDMS باستخدام PDMS. ومع ذلك ، قبل أن نفعل ذلك ، من الضروري أولا جعل هذه القوالب السلبية غير لاصقة عن طريق الطلاء بالفلورو.

نقوم بذلك في غرفة بلازما مائة واط بكامل طاقتها لمدة دقيقة واحدة. بعد السماح للغرفة بضخ العودة إلى البلازما ، يولد هذا مجال غاز أيوني يحفر السطح العلوي PDMS ويجعله أكثر الالتصاق بجزيئات الفلورو Cy Lane. بعد إزالة القوالب السالبة من المجفف الفراغي ، يمكنك أن ترى هنا ما تبقى لنا هو مجموعة من ثلاثة ميكرون × 10 ميكرون بعمق آبار في طبقة PDMS غير لاصقة.

من أجل تجديد الكاتيل العمودي ، الذي نستخدمه لركائز mpad ، من الضروري التخلص مرة أخرى من هذا باستخدام نفس خليط PDMS الخاص بنا وهذا سيترك لنا مجموعة إيجابية قائمة بذاتها من الكائنات المرنة ، والتي تعكس بشكل مماثل سيد السيليكون الذي صنعناه سابقا. تتمثل الخطوة الأولى في هذا الإجراء في نقل قوالبنا السالبة غير اللاصقة إلى رقصة متصاعدة صنعناها من شرائط PDMS وشريحة مجهر زجاجي. سيصبح سبب هذه الحفارة واضحا في الخطوة التالية.

في هذه المرحلة ، يمكننا إيداع قطرة صغيرة من نفس خليط 10 إلى واحد من PDMS إلى الرابط المتقاطع بالفعل Degas على السطح العلوي لكل قالب من قوالبنا السلبية. هناك حاجة فقط إلى كمية صغيرة من PDMS حتى لا تعمل على حافة القوالب السالبة. في هذه المرحلة.

من أجل نشر PDMS بشكل كامل عبر السطح العلوي للقوالب ، يمكننا الاستيلاء على واحدة باستخدام الملقط ، وعكسها ، وتلامسها مع القالب المجاور الذي ينتشر بعناية حول PDMS لتغطية الركيزة بأكملها بالكامل. كن حذرا جدا في هذه الخطوة حتى لا تدخل المزيد من الفقاعات في الحل العلوي PDMS الذي يمكن أن يتكرر بعد ذلك مع البئرين الآخرين ، واثنين آخرين من القالب. الآن بعد أن أصبح لدينا طلاء PDMS أكثر اتساقا عبر السطح العلوي ، يمكننا وضع هذه الرقصة في مجفف فراغ لإزالة أي فقاعات قد تكون محاصرة في فيلم PDMS فوق قوالبنا السلبية.

هذه العملية عادة حوالي 30 دقيقة. بينما أثناء تفريغ قوالبنا السلبية ، يمكننا تنظيف الركائز الزجاجية مقاس 22 × 22 ملم ، والتي ستصبح مكان التركيب النهائي للوسادات. تتمثل الخطوة الأولى في هذه العملية في تفجير أي جزيئات غبار باستخدام النيتروجين المضغوط.

سنقوم بتعريض زلاقات الغطاء الزجاجي لبلازما الغاز ، مما يؤدي إلى رماد السطح وجعله أكثر التصاق ب PMS ، والذي سنلتزم به في الخطوة التالية. بعد السماح للطبقة العليا من PDMS ب DGAs لمدة 30 دقيقة تقريبا والبلازما التي تنشط زلات الغطاء الزجاجي ، يمكننا بعد ذلك إزالة القالب الخاص بنا وإحضار السطح العلوي لزلقات الغطاء الزجاجي ، والتي تعرضت لبلازما الغاز في ملامسة طبقة PDMS أعلى القوالب السالبة. عادة ما يساعد على ملامسة إحدى حواف الغطاء الزجاجي مع PDMS أولا ثم السماح لبقية الغطاء الزجاجي بالانزلاق في SH بحيث ينتشر PDMS بطريقة تشبه الورقة.

يساعد هذا في تقليل أي فقاعات يتم إدخالها في فيلم PDMS. في هذه المرحلة ، يمكننا الضغط برفق على السطح العلوي لانزلاق الغطاء الزجاجي باستخدام ملقطنا لدفع أي PDMS زائد بالإضافة إلى دفع انزلاق الغطاء لأعلى مقابل صليب PDMS في وسط القالب. سيمنع ذلك انزلاق الغطاء من التحرك أثناء معالجة PDMS.

نكرر هذا للركائز الأخرى. في هذه المرحلة ، يمكننا نقل القالب بالكامل إلى الفرن وخبزه على حرارة 110 درجة مئوية لمدة 22 ساعة. بعد السماح للمجموعة بأكملها بالتبريد إلى درجة حرارة الغرفة ، يمكننا بعد ذلك إزالة ركائزنا وعكسها وتقشير القالب السالب بعناية من زلة الغطاء الزجاجي.

من المهم القيام بذلك ببطء وبشكل موحد لتجنب سحق الأعمدة أو تمزيقها من الركيزة الزجاجية. يمكننا أن نرى أنه بعد تقشير القالب السلبي ، يتبقى لنا مجموعة من الكابوليور التي تحاكي بدقة Silicon Master فقط التي هي الآن موجودة فيها ، فهي مصنوعة من مطاط PDMS مرن. حسنا ، في هذه المرحلة ، قمنا بإرشادك إلى كيفية إنشاء Silicon Master لركائز Emad الخاصة بنا.

لقد استخدمنا بعد ذلك عملية تشكيل نسخة طبق الأصل لإنشاء نسخة طبق الأصل باستخدام البوليمر المرن A-P-D-M-S بحيث تصبح الكابولات الآن مرنة للسماح للخلية بالانتشار والانكماش وتحويل الكابولات في هذه العملية. في هذه المرحلة ، تكون ركائزنا جاهزة للمعالجة لزراعة الخلايا. الآن بعد أن رأينا كيفية تصنيع وتكرار القوالب لصنع المحررين ، سنقوم ببعض الخطوات الإضافية من أجل جعل EDS وظيفيا حتى نتمكن من ثقافة أنفسنا ثم تحليل قوى الجر.

لكن قبل أن نفعل ذلك ، نحتاج إلى القيام بثلاثة أشياء. نحن بحاجة إلى جعل نصائح المنشورات لاصقة للخلايا. ثانيا ، نحتاج إلى تسمية PDMS بشكل فلوري للمساعدة في تصور وتحليل الانحرافات اللاحقة.

وثالثا ، نحتاج إلى جعل الجدران الجانبية للأعمدة وكذلك قاعدة الأعمدة غير لاصقة للخلايا بحيث تمارس قوى الجر فقط عند أطراف المنشور. لذلك سنرى كيف تسير هذه الخطوات عبر استراتيجية قائمة على طباعة جهات الاتصال الدقيقة في الدقائق اللاحقة. لكن أولا ، الخطوة التالية هي تنظيف P-D-S-P-D-M-S الزائدة من eds.

كما ذكرت ، فإن الخطوة الأولى هي أخذ ركيزة EDS ، والتي أظهر لك ويست للتو كيفية إنشائها وتقليمها. تنزلق PDMS الزائدة الناتجة عن معالجة الغطاء الزجاجي ضد القالب السالب واستخدام تقليم شفرة حلاقة حادة. PDMS الزائدة ، يمكنك القيام بذلك عن طريق وضع شفرة الحلاقة عموديا لأسفل على الركيزة عند حافة الأعمدة ثم كشطها بعيدا.

ويمكنك استخدام إصبع واحد لتثبيت زلة الغطاء في مكانها حتى لا تتحرك زلة الغطاء. لذا فإن ما ينتهي بنا الأمر هو ركيزة وسادة M تم تنظيفها من الحطام وبالتالي يمكن الوصول إليها بسهولة. لذلك بالنسبة للخطوة التالية ، يتعين علينا الاتصال الجزئي ، وطباعة MPAs لتقديم نصائح المنشورات اللاصقة.

من أجل القيام بذلك ، نحتاج أولا إلى إنشاء طوابع ، وهذه العملية سهلة للغاية. نقوم ببساطة بخلط PDMS بدلا من نسبة 10 إلى واحد ، وهي نسبة واحد إلى 30 إلى واحد. نسكب في طبق بتري بحيث يكون ارتفاع PDMS حوالي سنتيمتر واحد.

دعها تنزج. أي دع الفقاعات ترتفع إلى أعلى PDMS وتعالج تفاعل الربط المتقاطع في الفرن عند 60 درجة لمدة ساعة واحدة بعد إخراج الطبق من الفرن وتركه يبرد ، أنا الآن جاهز لقطع الطوابع. لذا مرة أخرى ، باستخدام نفس النوع من شفرات الحلاقة ، قم ببساطة بقصها بالضغط عموديا لأسفل في PDMS حتى تتلامس مع الجزء السفلي من طبق بتري.

الآن اتجاه الطابع هو شيء نريد الانتباه إليه. سيكون سطح الختم هو جانب PDMS الذي تم إلقاؤه على قاع طبق بتري بحيث يظل مسطحا. لذلك في هذا المربع الكبير من PDMS الذي قمت بقصه ، أصبح سطح الختم متجها الآن لأعلى.

الآن هذا الطابع أكبر بكثير من وسادات M ، لذلك سأقوم بقصه إلى حجم وسادة M واحدة مرة أخرى عن طريق القطع بشفرة الحلاقة ، لأنه من الصعب جدا معرفة الاتجاه الصحيح للختم بالعين ، سأضع القليل من الشق في ما سيكون الجانب الخلفي من الختم الذي هو الجانب غير الوجه تماما مثل هذا. ويمكنني بعد ذلك إزالة الختم من البلاطة الأكبر. ولدي الآن ختم A-P-D-M-S للخطوة التالية.

نريد تنظيف طوابع PDMS. نظرا لأنه من المحتمل جدا أن يكون الغبار من الغلاف الجوي قد استقر على طوابع PDMS أثناء قصها. هذه عملية نضع فيها العدد المطلوب من طوابع PDMS في طبق البلورة هذا ونملأ طبق طبق البلورة بنسبة 100٪ من الإيثانول.

لذا ما عليك سوى إضافة ما يكفي من الإيثانول لتغطية وجه الطوابع ، لكن الكمية الدقيقة من الإيثانول المضاف ليست مهمة. ثم ضع قرص التبلور في جهاز الصوتنة وقم بصوتنة الطوابع لمدة خمس دقائق. بعد انتهاء الدقائق الخمس ، سننتهي من تعقيم الطوابع ونقوم بما تبقى من طباعة التلامس الدقيق التي تعمل على تشغيل وسادات M في غطاء مزرعة الأنسجة المعقمة.

لذلك نحن الآن في غطاء زراعة الأنسجة حيث يمكننا إنهاء تعقيم الطوابع. للقيام بذلك ، نأخذ الطوابع من طبق التبلور ، ونغمسها في طبق مليء بالإيثانول لشطف أي حطام متبقي ، ونغمسها أخيرا في طبق من الماء لشطف الإيثانول. ثم نقوم بتيار من النيتروجين ، بتجفيف الطوابع حتى تختفي القطرات المرئية.

لذا في الخطوة التالية ، علينا حبر الطوابع بمحلول البروتين. محلول البروتين الذي نستخدمه هو 50 ميكروغراما لكل مل من الفيبرين في ماء DEI. ما عليك سوى أخذ بعض محلول البروتين في الماصة ووضع قطرات من محلول البروتين على وجه الطوابع.

تريد القيام بذلك عن طريق وضع قطرات صغيرة على حافة وجه الطابع. أولا ، كرر هذا لجميع الطوابع التي ستستخدمها وكان يجب أن أفعل ذلك مسبقا. لذا فإن الخطوة التالية بعد وضع النقاط على حواف جميع الطوابع هي توصيل تلك القطرات وملء محلول البروتين على وجه الطوابع.

السبب في قيامنا بذلك هو أن محلول البروتين في القطرات والقطرات الموجودة أسفل القطرات ويجعل سطح الطوابع محبا للماء ، مما يسهل نشر بروتين المصفوفة خارج الخلية. لذا مرة أخرى ، كرر هذا لجميع الطوابع التي تستخدمها الآن بعد أن نشرنا محلول البروتين على وجه الطوابع ، والخطوة الأخيرة في كتابة الطوابع هي التأكد من تغطية الحواف. للقيام بذلك ، نقوم ببساطة بزاوية الماصة وتشغيلها على طول وجه الختم بحيث تتلامس مع كل من زاوية ختم PDMS ومحلول البروتين.

ومرة أخرى ، كرر هذا لجميع حواف جميع الطوابع التي تقوم بكتابها بالحبر. الآن بعد أن انتهينا من كتابة الطوابع ، قمنا بتعيين تلك الطوابع ، ونترك الطوابع في غطاء مزرعة الأنسجة لمدة ساعة واحدة لتسهيل الامتصاص الكامل للبروتين على وجه الطوابع. والآن بعد أن انتظرنا ساعة واحدة حتى تمتص البروتينات إلى متجرها ، وتمتص على سطح الختم ، حان الوقت الآن لشطفها بالماء وتجفيفها بالنيتروجين.

للقيام بذلك ، نأخذ الماء المعقم ونسكب الماء المعقم في الطبق الذي يحتوي على الطوابع. احرص على عدم صب الماء مباشرة على وجه الختم ويمكنك استخدام الماصة إذا لزم الأمر. الكمية الدقيقة من الماء التي تناولتها ليست مهمة طالما أنك ترفع مستوى الماء فوق محلول البروتين.

بعد ذلك ، باستخدام ملاقط معقمة ، خذ ختما واحدا ، واغمسها في طبق جديد من الماء واتركها بلطف مع النيتروجين. مرة أخرى ، ستعرف أنه جاف عندما ترى ، عندما لا ترى قطرات من محلول البروتين على الطابع. وكرر هذا لجميع الطوابع التي تقوم بمعالجتها واحدة تلو الأخرى.

والآن بعد أن شطفنا الطوابع الجافة ، فقد حان الوقت لتنشيط ركائز mpad عن طريق معالجتها بالأوزون بالأشعة فوق البنفسجية. لمدة سبع دقائق ، أزيل غطاء طبق بتري من الأعلى ، من أعلى الطبق. لأنك ، نظرا لأن البوليسترين ماص للأشعة فوق البنفسجية ، أضع الطبق بعد ذلك في معالج الأوزون بالأشعة فوق البنفسجية ، وأغلق الدرج ، وأضبط الوقت لمدة سبع دقائق واتركه.

لقد عدنا الآن إلى غطاء مزرعة الأنسجة وقد حان الوقت لختم ركائز mpad ، التي تمت معالجتها للتو بالأوزون للأشعة فوق البنفسجية. للقيام بذلك ، ارفع طوابعنا المغسولة والمجففة بالملقط. يمكنك التعامل مع الطوابع من الجانبين ، لكن لا تلمس وجه الطابع.

تريد ضبط الختم في الملقط بحيث يمكن الوصول إلى جانب البروتين. ثم تقوم بعكس الملقط ، مع الأخذ في الاعتبار أن جانب البروتين يعتمد لأسفل ويجعل الختم ملامسا ببطء مع eds. الطابع الواحد إلى 30 لزج جدا ، لذلك قد تضطر إلى استخدام زوج ثان من الملقط لتحرير الختم من الملقط.

يمكنك إسقاط الختم لأسفل من ارتفاع حوالي ملليمترين إلى حوالي ثمانية ملليمترات على الدرجات. ثم قم بإمالة طبق emeds لأعلى واضغط لأسفل برفق باستخدام الملقط من أجل إنشاء اتصال بين الختم و eds. ستعرف متى يتم الاتصال بإحدى طريقتين.

الأول هو النظر إلى سطح الضعف الجنسي من خلال جانب الطابع. قد يكون من الصعب رؤية هذا على الكاميرا ، لكن بالعين يمكنني أن أرى بوضوح أن الختم يتلامس مع السطح من خلال النظر إلى السطح من خلال جانب الطابع. الطريقة الثانية لضمان الاتصال هي مع p ، هي إخراج طبق بتري من غطاء مزرعة الأنسجة مع الغطاء وعرضه تحت المجهر المقلوب.

من خلال تصور أنماط التداخل مع المجهر ، يجب أن تكون قادرا على معرفة متى وما إذا كان الختم ملامسا ل eds. بمجرد تحديد الاتصال ، يحتاج الختم فقط إلى البقاء على اتصال بهذا ، مع الركيزة ed لبضع ثوان. لذلك حان الوقت الآن لإزالة الختم.

للقيام بذلك ، قم بطي Eds لأسفل بزوج واحد من الملقط وبحركة واحدة سلسة ، انزع الطابع. تأكد من تتبع الطوابع التي قمت بختمها والطوابع التي استخدمتها سابقا. وكرر هذا الإجراء مرة واحدة لكل EMPAs لكل ركيزة ترغب في استخدامها.

الآن بعد أن قمنا بختم EMPAs ، فإن الخطوة التالية هي تعقيمها ثم احتضانها في صبغة محبة للدهون تسمى صبغة العين. داي هو جزيء محب للدهون يتم تمييزه بالفلورسنت ، لذلك ينتشر في PDMS على مدار الوقت الذي يسمح لنا بتصور الانحرافات اللاحقة تحت المجهر. لذا ما سأفعله هو أخذ كل ركيزة إمبا فردية واحدة تلو الأخرى وغمرها في 100٪ من الإيثانول ، 70٪ الإيثانول DI الماء DI

وأخيرا ، خمسة ميكروغرام لكل مل من محلول dii. محلول DII هو الفلورسنت ، لذلك لتقليل تعرضه للضوء المحيط وتقليل تبييض الصور ، نقوم بتغطية الأطباق بورق الألمنيوم أثناء احتضانها في غطاء مزرعة الأنسجة لمدة ساعة واحدة. الآن بعد أن انتظرنا ساعة واحدة حتى تحتضن وسادات EM في محلول DAI ، يمكننا إزالة رقائق الألومنيوم وشطف محلول DAI.

نقوم بشطف عن طريق القيام بثلاث غمرات متتالية في الماء المعقم وأخيرا ، نغمر في محلول 0.2٪ Onic F1 27. هذا هو 0.2٪ الوزن لكل حجم أثناء جميع خطوات الغمر ، من المهم تقليل الوقت الذي تتعرض فيه وسادات EM للهواء. هذا لمنع تلف ركائز الضعف الجنسي ومنع عمودين من الانهيار على بعضهما البعض على وجه التحديد.

0.2٪ onic F1 27 عبارة عن بوليمر مشترك ثلاثي الكتل يتكون من مجالات محبة للماء وكارهة للماء. من المعروف أن المجال المحب للماء يقاوم امتصاص البروتين وبالتالي التصاق الخلية بينما يرتبط المجال الكارهة للماء بالمزاج إلى PDMS الكارهة للماء. وبالتالي ، عندما يتم نقع PDMS في F1 27 ، يرتبط F1 27 ب PDMS ويصد التصاق الخلية.

بعد ساعة واحدة من الحضانة في F1 27 المزمن في طبق بتري مغطى بورق الألمنيوم ، يمكننا شطف F1 27 عن طريق الغمر المتسلسل في الماء المعقم والماء المعقم و PBS. بعد الغمر في PBS وشطف المنتج F1 27 ، يمكننا بعد ذلك غمر ركائز eds في محلول زراعة الخلايا المفضل. يمكن أن يحتوي محلول زراعة الخلايا الذي غمرت فيه EMPAs للتو على مصل الدم و / أو عوامل النمو الأخرى و / أو المكملات الغذائية مثل البنسلين والستربتومايسين.

كل هذه المكونات متوافقة تماما مع علاجات EMPAs. الآن الخطوة التالية ، بمجرد غمر المحرر في محلول زراعة الخلايا هي زرع الخلايا المفضلة على eds. بالنسبة لهذا الإعداد التجريبي المعين ، سأقوم بزرع الخلايا البطانية الأبهرية الرئوية البقرية في ثلاثة أطباق مختلفة.

السبب في أنني أستخدم ثلاثة أطباق مختلفة هو أنني سأعالج اثنين من الأطباق بمثبطات اللمس المعروفة لمنع انحرافات الأعمدة حيث سنكون قادرين على فحصها في وقت لاحق. لذلك لزرع الخلايا ، آخذ ببساطة تعليق الخلية الخاص بي ، وأرسم الكمية المناسبة في الماصة والماصة بالتنقيط في كل طبق. أقوم بإضافة عدد كاف من الخلايا بحيث عندما أقوم بإجراء الفحص لقياس قوى الجر ، توجد الخلايا كخلايا خلية واحدة على eds.

سيعتمد المبلغ الذي تضيفه على منطقة الانتشار بالإضافة إلى معدل نمو خلاياك الخاصة. عادة ما نزرع ما بين 1500 و 5000 خلية لكل سنتيمتر مربع من الركيزة. بعد الانتهاء من بذر الخلايا أو تحرير تعليق الخلية ، قم بإسقاط المزرعة بالصخور برفق ذهابا وإيابا عدة مرات في اتجاهات متعامدة لخلط تعليق الخلية في طبق الثقافة.

كرر هذه العملية لجميع الركائز التي تستخدمها. مباشرة بعد بذر الخلايا ، ضعها في حاضنة 37 درجة عند مستوى مناسب من ثاني أكسيد الكربون لتخزين درجة الحموضة ووسائط زراعة الخلية. بعد ساعتين ، بعد ساعتين تقريبا من بذر الخلايا ، من المناسب شطف الخلايا عن طريق نقل الركائز من طبق واحد من الوسائط إلى طبق جديد من نفس وسائط زراعة الخلية.

سبب هذا الشطف هو أن معظم الخلايا ستبدأ في الانتشار وستصل إلى منطقة انتشارها النهائية تقريبا بساعتين. عن طريق شطف الخلية ، الركائز ، تقوم بإزالة أي خلايا عائمة من وسط زراعة الخلايا. بهذه الطريقة ستظهر فقط الخلايا التي تم ربطها ب EDS وبدأت في عملية الانتشار في مقايسة نقطة النهاية لقوى الجر.

أحد المقايسات التي يمكننا إجراؤها مع الخلايا التي تمت زراعتها على MPAs هو التصوير بفاصل زمني لفحص ديناميكيات الانقباض الخلوي كميا. على وجه الخصوص ، فإن ديناميكيات الانقباض الخلوي استجابة للعوامل القابلة للذوبان مثيرة للاهتمام. من المعروف أن العوامل القابلة للذوبان مثل المركبات البيولوجية والمركبات الاصطناعية تزيد أو تقلل أو لها تأثيرات غير معروفة على الانقباض الخلوي.

في تجربة الخلية الحية هذه ، سنستخدم مجهر التألق epi المقلوب. في مرحلة المجهر ، لدي صندوق حاضنة صغير تم توصيله بمنظم حراري للحفاظ على درجة الحرارة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2. سنقوم بالتصوير بتكبير عال بهدف APO بخطة 60 ×.

الآن سنذهب لإعداد ركيزة التأثير للتصوير. الهدف 60 × الذي نستخدمه للتصوير له مسافة عمل تبلغ 200 ميكرون ، وهي أرق بكثير من سمك طبق زراعة الأنسجة الذي زرعنا فيه الخلايا في وقت سابق. لذلك ، لا يمكننا تصوير الخلايا الموجودة على الغرسات في طبق زراعة الأنسجة.

للتغلب على هذه المشكلة ، نستخدم هذه الأطباق ذات القاع الزجاجي. سأقوم الآن بنقل الركيزة إلى الطبق السفلي الزجاجي رأسا على عقب بحيث تكون الخلايا وأطراف الأعمدة في واجهة الطبق السفلي الزجاجي. لذلك ، عندما يتم وضع هذا على المجهر ، تكون مسافة العمل بين الخلايا والهدف أقل من 200 ميكرون.

الآن نحن مستعدون لوضع هذا على المجهر للتصوير. سأقوم الآن بفتح غرفة حاضنة الخلية الحية ، وأضع العينة بالداخل واستبدل غطاء غرفة الحاضنة. في هذه المرحلة ، سأقوم بمسح الركيزة بحثا عن خلية مناسبة.

للصورة. الطريقة الأكثر فاعلية للقيام بذلك هي استخدام هدف الوجه الأول 10 × ، والذي سيسمح لي برؤية حقل أوسع من الركيزة والعثور على خلية بسرعة أكبر. معاييري للخلية الجيدة هي خلية واحدة.

لا ينبغي أن تلمس أي خلايا مجاورة ، كما يجب أن تكون متوسطة الحجم مقارنة بجميع الخلايا الأخرى الموجودة على الركيزة ، لقد وجدت خلية مناسبة للنظر إليها. الشيء التالي الذي سأفعله هو تبديل الهدف إلى 60 x لإلقاء نظرة على الخلية بتكبير عالي. للقيام بذلك ، نقوم بإلغاء تركيز الهدف ، لذلك لا تصطدم بالمرحلة أثناء الدوران.

أثناء تدوير البرج ، افتح الغرفة ، قم بتدوير المقابلة الموضوعية 60 × 60 × الهدف جزئيا 60 × 60 × الهدف هو عدسة غمر بالزيت ، لذلك يتعين علينا وضع قطرة من زيت الغمر على العدسة الموضوعية. الآن سننتهي من تدوير الturt لإحضار 60 x إلى موضعه. سنغلق غرفة الحاضنة ونعيد تركيز الهدف لإعادة الخلية إلى التركيز.

بمجرد ضبط موضع الخلية وتركيزها ، سأقوم بالتبديل إلى كاميرا CCD لمعاينة الخلية على شاشة الكمبيوتر ثم بدء التصوير بفاصل زمني. بالنسبة لهذه التجربة ، سنكون ، سأقوم بجمع كل من صور الطور والفلورسنت بفاصل زمني واحد ، لذلك بدأ التصوير بفاصل زمني وسأتركه يعمل لمدة 10 دقائق أو 10 إطارات ، وعند هذه النقطة سأضيف المصل 10 دقائق قد انقضت الآن. في هذا الوقت ، سأفتح الغرفة وأضيف مصلا إلى الطبق لتحفيز الانقباض في الخلية.

يزال المؤقت قيد التشغيل ، لذلك يجب أن أكون سريعا في القيام بذلك الآن ، سنواصل تصوير الخلية لمدة 30 دقيقة لمتابعة أي تغييرات في الانقباض. بعد الانتهاء من التصوير بفاصل زمني ، يمكن تسلسل الصور في فيلم معروض. فيما يلي فيلمان عن صور الطور والفلورة.

على اليسار يوجد فيلم مرحلي لخلية شفافة في الغالب محددة باللون الأسود. تنتشر الخلية عبر أطراف 20 عمودا ، وهي هياكل دائرية مرتبة في شبكة مستطيلة. يوجد على اليمين فيلم فلورسنت لنفس الخلية ، لكن المنشورات فقط مرئية.

إذا قمت بتشغيل هذه الأفلام ، فسترى أن المنشورات المرفقة بالخلية ضعيفة في البداية ، وتنحرف بشكل جيد ، وتنحرف قليلا جدا عن الشبكة المستطيلة. قرب منتصف الفيلم ، أضفت المصل إلى وسائل الإعلام. يحفز المصل الخلية على زيادة الانقباض.

عندما تمارس الخلية قوى جر أكبر على الأعمدة الأساسية ، تبدأ الأعمدة على طول محيط الخلية في الانحراف إلى الداخل. في فيلم الفلورسنت ، ترى الآن المنشورات تنحرف بشكل كبير عن مواقعها في الشبكة المستطيلة. كما سأصف لاحقا ، يمكن استخدام إزاحة مواضع المنشورات هذه في هذه الصور لتحليل قوى الجر لهذه الخلية.

السابق ، رأينا كيف قمنا بإنشاء ركائز mpad وكيف نقوم بتشغيلها من أجل زراعة الخلايا. الآن ستلاحظ أنني وضعت ركائز MPAD النهائية في ثلاثة أطباق مختلفة لزراعة الخلايا. كانت الخلايا تنمو بين عشية وضحاها ، والآن ما سأفعله هو معالجة كل طبق زراعة خلية فردي بعامل قابل للذوبان مختلف يعدل الانقباض بطريقة معروفة.

يمكننا بعد ذلك قياس قوى الجر الناتجة بطريقة كمية بعد تثبيت الخلايا لمدة 30 دقيقة. بعد إضافة العوامل القابلة للذوبان بعد 30 دقيقة من إضافة مثبطات الانقباض ، حان الوقت الآن لإصلاح الخلايا بالألدهيد البارالي الشكل لتأمين الحالة الحالية لقوى الجر. للقيام بذلك ، من المهم استخدام الألدهيد البارافورم الذي يحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم ، ونستخدم الألدهيد الطلائفي بنسبة حجم 3.7٪ طريقة غمر الركائز في الألدهيد الطلائلي ، آسف ، هي نفس طريقة غمر الركائز في هذا ، في RINs المختلفة أثناء الوظيفية.

أي أنه من المهم عدم ترك الركائز تجف لأن ذلك قد يؤدي إلى ما بعد الانهيار. بعد أن أقوم بنقل الركائز ، قمت بنقل الركائز ، وتركتها تحتضن في الألدهيد الشكلي لمدة 20 دقيقة. بعد انتهاء 20 دقيقة ، نزيل الركائز من الألدهيد الشكلي الآن والآن بعد أن تم إصلاح الخلايا ، يمكننا معالجة هذه العينات من أجل تلطيخ المناعة القياسي.

للقيام بذلك ، نضع الركائز متجهة لأعلى على المعلمة والماصة على ما يكفي من PBS لتغطية الركيزة والاحتفاظ بها أسفل PBS. ثم نقوم بشطف الركيزة ثلاث مرات باستخدام PBS لإزالة أي ألدهيد طفيلي قد يترك في الثقافة. بعد شطف الركيزة ثلاث مرات باستخدام PBS ، يمكننا نقل الركيزة لتلوين المناعة في اتجاه مجرى النهر.

نقوم بذلك عن طريق التعامل مع الركيزة بزوج من الملقط وقلبها في الخطوة الأولى في تلطيخ المناعة ، وهذا عامل نفاذ. في هذه الحالة، نستخدم 0.2٪Triton X في PBS. ومع ذلك ، يمكن للمستخدم استخدام أي عامل تخصيص أكثر ملاءمة لاحتياجاته.

نكرر هذا لجميع ركائزنا وهذه هي الطريقة التي نتعامل بها مع الركائز أثناء عملية البقع المناعية. بعد التلوين المناعي ، يتم تثبيت الركائز على شريحة زجاجية قياسية بحجم بوصة واحدة في ثلاث بوصات ، والتي يمكن معالجتها بعد ذلك على أي مجهر مضان epi ، سواء كان مقلوبا أو منتصبا. من خلال معالجة العينات على مجهر متحد البؤر ، يمكننا التركيز على الجزء السفلي من الأعمدة للحصول على un المنحرف الذي هو المواضع الفارغة.

يمكننا بعد ذلك التركيز على نصائح المنشورات ، والتقاط صورة أخرى للمشاركات ، ومن خلال مقارنة الصورة العلوية مقابل الصورة السفلية ، يمكننا قياس انحرافات الأعمدة وحساب قوى الجر للخلايا التي تولدتها الخلايا من أجل إنتاج مثل هذه الانحرافات. من خلال القيام بهذه العملية للعديد من الخلايا المختلفة في عدة ظروف مختلفة، يمكننا بعد ذلك مقارنة قوى الجر المتولدة في الظروف المختلفة. الآن بعد أن جمعنا صورا لكل من الخلايا الحية والثابتة أو المهمة التالية هي قياس الانحراف ، لقياس قوى الجر في الخلايا.

للقيام بذلك ، للقيام بذلك ، قمنا بكتابة برنامج كمبيوتر في matlab. هذه هي الصور الثلاث التي سنستخدمها في هذا التحليل. الصورة الأولى هي صورة طورية للخلية.

إنه مفيد لتحديد موقع الخلية. الصورة الثانية هي صورة فلورية لقمم المنشورات. نستخدم هذه الصورة لتحديد مواقع المشاركات في طرفها.

كما ترون ، يتم انحراف بعض هذه المنشورات وانحرافها عن الشبكة المستطيلة التي توجد فيها معظم المنشورات مثل هذا المنشور. وهذا المنشور. الصورة الثالثة التي سنستخدمها هي الصورة الأساسية ، والتي تلتقط موضع المشاركات في مستوى بؤري يعبر من خلال قاعدتها.

في هذا المستوى ، يجب وضع كل من المراكز المنحرفة وغير المنحرفة في وضع الراحة ، un ، غير منحرفة. في الشبكة المستطيلة ، يمكنك أن ترى أن المنشورات التي تم انحرافها في الصورة الثانية في قاعدتها ، هي في موضع FL الخاص بها. تستخدم هذه الصورة للعثور على موضع المنشور ، إنه تحت الموضع المنعكس.

بعد ذلك ، نقوم بتحميل برنامج MATLAB ، والذي سيطالبنا بتحميل هذه الصور الثلاث. قم بتسمية الملف. ترى صورة المرحلة.

سنرسم مربعا حول الإشارة إلى مكان الخلية ، حتى يعرف البرنامج المنشورات التي يجب تحليلها. يقوم البرنامج بعد ذلك بأداء الكثافة وتحديد عتبة الصورة التي تم اقتصاصها لتحديد إحداثيات OID للمشاركات. على اليسار توجد صور مصنفة للمشاركات من الصورة العلوية بينما يوجد على اليمين صور لنفس المنشورات من الصورة الأساسية.

بعد الحصول على المشاركات ، إحداثيات OID ، يمكن للبرنامج بعد ذلك ، تحديد متجهات الإزاحة بين طرف وقاعدة كل منشور. يمكن تحويل متجهات إزاحة ما بعد هذه إلى متجهات قوة بضربها في ثابت الزنبرك للعمود. يمكننا تحليل هذه القوى الخلوية بعدة طرق ، مثل متوسط القوة لكل خلية أو متوسط القوة لكل عمود.

إحدى النتائج المفيدة هي مؤامرة الجعبة التي يمكننا من خلالها تصور التوزيع المكاني للقوى. هذه هي الخلية التي قمنا بتحليلها للتو ويمكنك أن ترى أنني قمت بتراكب أسهم صفراء على الأعمدة التي ترتبط بمقدار القوة والإشارة في اتجاه القوة. من خلال تكرار عملية تحليل الصور هذه لصور التسلسلات مثل تلك المطلوبة في فيلم الفاصل الزمني الخاص بنا ، يمكننا إنشاء تسلسل زمني.

إليكم فيلم للخلية التي حفزناها بالمصل. كما ترون ، تماما كما تمت إضافة المصل ، زادت الخلية من الانقباض وانحرفت الأعمدة أكثر. بالإضافة إلى ذلك ، يمكننا تحديد القوى لأعداد أكبر من الخلايا التي تعرضت لظروف مختلفة ثم تم تثبيتها ملطخة كما يتضح من مخططات الجعبة هذه التي تظهر خلية معالجة بمركب تحكم مقابل الخلايا المعالجة بمثبطات الانقباض.

كما تستطيع. كما ترون ، فإن متجهات القوة على الخلية في حالة التحكم أكبر من أكبر في الطول من متجهات القوة. في الحالتين اللتين تم فيهما استخدام مثبطات الانقباض ، قمنا بتغطية الكثير من المواد المادية هنا لوصف ركيزة المسار من التصنيع الدقيق إلى إعداد العينة والتجريب والتحليل لإثبات تعدد الاستخدامات لهذه الركائز.

لقد وصفنا مقياسين مختلفين ، تصوير الخلايا الحية ومقايسة العينة الثابتة ، وقمنا بتحليل الخلايا التي تم الحصول عليها من كلا المقايسين وعرضنا مخططات الجعبة وأفلام الجعبة. باستخدام هذه الأداة القوية ، يمكن للمرء إجراء مجموعة متنوعة من التحليل المكاني والزماني لانقباض الخلية. كما رأيت ، اعتمدت هذه الطريقة على العديد من التخصصات المختلفة ، بما في ذلك تلك الخاصة بالتصنيع الدقيق ، وبيولوجيا الخلية الأساسية ، وعلوم السطح ، وتحليل الصور ومعالجتها ، وغيرها الكثير.

ولأن طريقتها ترتكز على العديد من التقنيات الهندسية المختلفة على وجه التحديد ، يمكن تخصيص المعلمات مثل هندسة ما بعد والعوامل القابلة للذوبان المستحثة وطرق تحليل الانحرافات اللاحقة وفقا لاحتياجات المستخدم. نأمل أن يتم استخدام العرض المرئي لهذه الطريقة الذي حددناه في ال 20 ، 30 دقيقة الماضية كنقطة انطلاق لتحليلات أخرى وأعمق في التنظيم والعواقب الوظيفية وتوليد قوى الجذب الخلوي.