وبنقل العدوى إلى الإنسان Nucleofecting الجذعية المحفزة المستحثة خلايا

الهدف العام من هذه التجربة هو تحقيق كفاءة ترانسفكشن عالية في الخلايا الجذعية البشرية المستحثة متعددة القدرات باستخدام بروتوكولات ترانسفكشن وتأثير نووي محسنة. ويتم تحقيق ذلك أولاً من خلال إنشاء مزارع خالية من الخلايا المغذية للخلايا الجذعية البشرية المستحثة متعددة القدرات. وبالنسبة لعملية الترانسفكشن، يتم وضع الخلايا الجذعية البشرية المستحثة متعددة القدرات على gelt أو TRX أو matrigel طوال الليل.

بينما يتم الحصول على تجمعات خلوية صغيرة باستخدام التريبسين لعملية النقل النووي، يتم إضافة خليط من DNA البلازميد وكاشف ترانسفكشن "gene juice" إلى الخلايا المزروعة، ثم يتم تدوير الطبق وحضنه عند 37 درجة مئوية. يتم إجراء النقل النووي لمعلق خلايا IPS البشرية في جهاز النقل النووي، ثم يتم إعادة تعليق الخلايا في وسط مُكَيَّف، وتُحضن عند 37 درجة مئوية. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر تلاعباً جينياً فعالاً من خلال كفاءة ترانسفكشن عالية في خلايا IPS البشرية.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل طرق التثقيب الكهربائي للنقل الجيني (transfection electroporation) وطرق التأثير النووي الموصوفة سابقاً، في إمكانية تحقيق كفاءة نقل جيني عالية في خلايا IPS البشرية بنتائج متسقة وبشكل روتيني في مختبرنا. كما تضمن بروتوكولاتنا تقليل موت الخلايا إلى أدنى حد بعد التعديل الوراثي. وبناءً على ذلك، تسمح بروتوكولاتنا بتوليد خطوط خلايا IPS بشرية معدلة وراثياً بشكل سريع وعلى نطاق واسع. وقبل تكييف الخلايا الجذعية البشرية المستحثة متعددة القدرات مع المزارع الخالية من الخلايا المغذية، قم بتحضير أطباق مغلفة بـ gelt TRX.

بعد ذلك، يتم تدليك الخلايا السلفية للخلايا المتقلبة البشرية (IPCs) التي تم الحفاظ عليها سابقاً على خلايا مغذية بكمية 1 mL من Accutane لكل بئر، وتحضينها عند 37 °C لمدة دقيقة واحدة وحتى تبدأ معظم الخلايا في الانفصال، ثم تضاف من 10 إلى 15 خرزة زجاجية إلى الخلايا ويتم تحريك الطبق بلطف. ثم يتم إضافة 2 mL من وسط knockout D-M-E-M-F 12 مع إجراء عملية التقطير بلطف. يتم نقل معلق الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي سعة 10 mL.

قم بطرد الخلايا مركزياً بسرعة 800 RPM لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. اشفط السائل الطافي، مع ترك كتلة خلايا IPSC البشرية سليمة. قم بالنقر بلطف على الأنبوب لتفريق كتلة الخلايا برفق.

يا ريس، قم بتعليق كريّة الخلايا الجذعية البشرية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) في حجم مناسب من وسط STEM pro ووزعها بين آبار طبق مطلي بـ TRE gel. وبناءً على معدل التكاثر، يمكن تمرير الخلايا الجذعية البشرية (iPSCs) بنسبة تقسيم تتراوح من 1:2 إلى 1:6. ضع الطبق بعناية في حاضنة تحتوي على 5% ثاني أكسيد الكربون ودرجة حرارة 37 درجة مئوية، وقم بهز الطبق بلطف لضمان توزيع الخلايا بشكل متساوٍ عبر الآبار.

يتم تغذية الخلايا يومياً. وعندما تصل الخلايا إلى 80% من درجة الالتحام (confluency)، تصبح جاهزة للنقل مرة أخرى إلى هلام جديد. يجب أن تكون الخلايا في الآبار المطلية بـ Rex، عند نسبة تقسيم واحد إلى اثنين، في حالة التحام تتراوح تقريباً بين 40 إلى 50%، وأن تكون موزعة بالتساوي على شكل مستعمرات صغيرة في الآبار المطلية بالهلام في يوم عملية التعداء (transfection) لتحقيق أقصى كفاءة للتعداء.

لبدء هذا الإجراء، قم بتحضير 100 µL من وسط knockout في أنبوب eend orph معقم سعة 1.5 mL. أضف 27 µL من كاشف ترانسفكشن gene juice، وامزجه جيداً ثم حضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، أضف 4 µg من plasmid DNA.

يعد اختيار البلازميد أمراً بالغ الأهمية لتحقيق كفاءة ترانزفيكشن مثالية. يحتوي البلازميد المستخدم هنا على بروتين فلوروسنت أخضر مُعزز يتم تحفيزه بواسطة محفز CAG، وهو محفز قوي نشط نسخياً في خلايا IPCs البشرية. يتم تحضين الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.

بعد مرور 15 دقيقة، أضف خليط DNA "gene juice" إلى الخلايا وقم بتوزيع السائل على الطبق. قم بتدوير الطبق بسرعة 1,200 RPM لمدة خمس دقائق لزيادة تلامس خليط عفن الخلايا (transfection mixture) مع الخلايا السلفية القلبية البشرية human IPCs في البئر. قم بتحضين الخلايا عند 37 درجة مئوية طوال الليل وحتى اليوم التالي.

راقب كفاءة عفن التحويل في يوم التأثير النووي، وقم بمعالجة الخلايا الجذعية البشرية المستحثة متعددة القدرات (IPCs) مسبقاً بـ 10 micromolar من مثبط rock لمدة ساعة واحدة على الأقل عند 37 degrees Celsius أثناء المعالجة المسبقة لخلايا human IPS CS. قم بتحضير 82 microliters من محلول التأثير النووي للخلايا الجذعية البشرية في أنبوب sterile 1.5 milliliter eend orph. أضف 80 microliters.

أضف المكمل الأول واخلطه جيداً باستخدام الماصة. احضن المحلول عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. قم بتسخين ميديا الخلايا المغذية المكيفة المُحضرة مسبقاً و0.25% trypsin-EDTA مسبقاً إلى 37 درجة مئوية داخل كبينة التدفق الصفحي.

قم مسبقاً بتسمية أنبوب مخروطي معقم سعة 15 milliliter. أزل بعناية الوسط من مزرعة خلايا IPSC البشرية المراد إجراء النقل النووي لها، واغسل الخلايا برفق باستخدام phosphate buffered saline. اشفط الـ PBS وأضف trypsin، ثم حضن الخلايا عند 37 درجة Celsius لمدة ثلاث دقائق.

لضمان نجاح عملية النقل النووي، من الضروري عدم استخدام التربسين لتحليل الخلايا إلى خلايا مفردة. بدلاً من ذلك، يجب تجزيء الخلايا إلى تكتلات صغيرة تتكون من خليتين إلى ثلاث خلايا. قم بتجزيء الخلايا برفق باستخدام رأس ماصة P 1000 إلى تكتلات صغيرة تتكون من خليتين إلى ثلاث خلايا.

اغسل قاع البئر عن طريق السحب والتفريغ المتكرر بالمصّة للتأكد من انفصال جميع الخلايا السلفية القلبية البشرية (human IPCs) تماماً. ثم انقل معلق الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter مُصنف. بعد ذلك، أضف تسعة milliliters من وسط نمو الخلايا الليفية الجنينية للفأر.

لتعطيل مفعول التريبسين، يتم تدوير الخلايا بسرعة 800 RPM لمدة ثلاث دقائق. يُسحب السائل الطافي (SUP) بعناية مع الحفاظ على سلامة كتلة الخلايا المترسبة. تُعلق الخلايا في 100 microliters من محلول مؤثر نووي للخلايا الجذعية البشرية المسخن مسبقاً.

باستخدام طرف ماصة سعة 1 mL، يتم نقل الخلايا إلى أنبوب تأثير نووي. أضف 4 µg من DNA البلازميد إلى معلق الخلايا في الأنبوب، ثم اخلط الخلايا وDNA عن طريق التدوير اللطيف. انقر على الأنبوب مرتين على سطح خزانة السلامة الحيوية.

أدخل الأنبوب في حامل المؤثر النووي الخاص بجهاز التأثير النووي. اختر البرنامج B 0 1 6 لخلايا التأثير النووي بالضغط على الزر x، وستظهر كلمة Okay عند اكتمال عملية التأثير النووي، والتي تستغرق عادةً من ثانية واحدة إلى خمس ثوانٍ. استخدم ماصة البلاستيك المرفقة في طقم التأثير النووي لاستعادة الخلايا المتأثرة نووياً؛ استعِد الخلايا عن طريق إعادة تعليقها في وسط CM مسبق التدفئة مع مثبط الصخر (rock inhibitor) في أنبوب sterile 1.5 milliliter eend orph معقم، ثم حضن الخلايا عند 37 °C لمدة 10 دقائق.

بعد 10 دقائق، استخدم رأس ماصة سعة 1 ml لنقل الخلايا قطرة تلو الأخرى فوق طبقات الخلايا المغذية. قم بحضن الخلايا عند 37 °C طوال الليل حتى اليوم التالي. راقب كفاءة عفن الخلايا (transfection efficiency).

تظهر هنا صور مجهرية ضوئية لخلايا RIV one البشرية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) التي تعبر عن EGFP، والتي تم ترانسفكشنها باستخدام gene juice على gel Rex بعد 12 ساعة من ترانسفكشن البلازميد. ترانسفكشن DNA في خلايا iPSCs البشرية باستخدام gene juice مع محفز قوي يؤدي عادةً إلى الحصول على أكثر من 60% من الخلايا التي تعبر عن المراسل EGFP في مقايسة الترانسفكشن المؤقت.

يمكن الحصول على خلايا تعبر عن EGFP أيضاً عن طريق النقل النووي كما هو موضح في هذه الصور لخلايا IPCs بشرية من خط RIV 1 تم استزراعها وتكوينها على خلايا مغذية بعد النقل النووي باستخدام إما برنامج النقل النووي B 0 1 6 أو برنامج النقل النووي A 0 2 3. أدى استخدام البرنامج B 0 1 6 إلى الحصول على ما يصل إلى 80% من الخلايا الموجبة لـ EGFP، بينما أنتج البرنامج A 0 2 3 أقل من 10% من الخلايا الموجبة لـ EGFP. علاوة على ذلك، يمكن اشتقاق مستنسخات مستقرة من خلايا h I PSCs المعدلة وراثياً والتي تعبر عن جين trends.

يظهر هنا مثال لمستعمرات من الخلايا الجذعية البشرية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) التي تعبر عن بروتين EGFP بشكل مستقر مع تعبير منتشر لبروتين EGFP مشتق من gene juice. تحتفظ هذه الخلايا بالتعبير التأسيسي لبروتين EGFP أثناء تمايز الجسم الجنيني. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية إجراء النقل النووي والترانسفكشن للخلايا الجذعية البشرية المستحثة متعددة القدرات.

يُعد التلاعب الجيني الفعال أداة أساسية لدراسة الجوانب المختلفة لبيولوجيا الخلايا الجذعية، ومن شأنه أن يسرع من استخدام خطوط خلايا IPS البشرية في الطب التجديدي.