إنشاء مزرعة الخلايا الدبقية في مولر التي تم الحصول عليها من شبكية العين الفئرانية

خذ شبكية العين الفأرية التي تحتوي على خلايا Müller Glaal أو MG والخلايا العصبية.

ضعها في محلول تفكك مع إنزيمات الجهاز الهضمي واحتضانها بهزاز لطيف لضمان توزيع الإنزيم بشكل متساو.

تعمل هذه الإنزيمات على تكسير المصفوفة خارج الخلية ، وفصل الخلايا الفردية.

ماصة شبكية العين لأعلى ولأسفل عدة مرات لتحرير الخلايا.

أضف مثبطا لوقف نشاط الإنزيم ، ثم جهاز الطرد المركزي.

تخلص من المادة الطافية.

أعد تعليق الخلايا في الوسائط التي تحتوي على عامل نمو خاص بخلايا MG.

نقل الخلايا إلى بئر واحتضانها.

بمرور الوقت ، يسهل عامل النمو في الوسائط نمو وتكاثر خلايا MG بينما تموت الخلايا العصبية غير المنقسمة.

قم بإزالة الوسائط. يغسل بمحلول ملح.

احتضان مع إنزيم هضمي لفصل الخلايا عن البئر.

اجمع الخلايا في أنبوب ثم جهاز الطرد المركزي.

تخلص من المادة الطافية التي تحتوي على الخلايا العصبية الميتة.

أعد تعليق خلايا MG في الوسائط لمزيد من التحليل.

تحضير خليط تفكك غراء DNase I كما هو موضح في المخطوطة. الآن ، باستخدام ماصة نقل ذات رأس متضخمة ، التقط شبكية العين. انتظر حتى تستقر شبكية العين في الجزء السفلي من الطرف ، وحرر شبكية العين ، دون HBSS مفرط ، في الأنبوب الذي يحتوي على خليط غراء DNase I.

بعد ذلك ، ضع الأنبوب على مغذي في الحاضنة واحتضنه لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية وبثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪. بعد ذلك ، قم بفصل الخلايا عن طريق سحب العينة بعناية لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة سعة 1 ملليلتر. بعد تفكك الخلايا ، أضف 275 ميكرولترا من مثبط البروتياز المبوي من مجموعة تفكك غراء لتحييد غراء ، واخلطها برفق عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل.

ضع الأنابيب في جهاز طرد مركزي ، وقم بالدوران عند 4 درجات مئوية لمدة 8 دقائق بقوة طرد مركزي نسبية تبلغ 300. أضف عامل نمو البشرة إلى الحجم المحسوب لوسط النمو المسخن مسبقا عند 37 درجة مئوية. قم بإزالة الأنابيب بعناية من جهاز الطرد المركزي.

دون لمس الحبيبات الموجودة في الجزء السفلي من الأنبوب ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية وبالكامل. الآن ، أعد تعليق حبيبات الخلية ب 500 ميكرولتر من وسط النمو المكمل بعامل نمو البشرة. بعد ذلك ، انقل تعليق الخلية إلى بئر واحد من اللوحة المكونة من 12 بئرا المسماة. اشطف الأنبوب ب 500 ميكرولتر أخرى من وسط النمو المكمل بعامل نمو البشرة ، وأضفه إلى البئر.

هز لوحة البئر بعناية. ثم ضع اللوحة في الحاضنة على حرارة 37 درجة مئوية مع ثاني أكسيد الكربون. ابدأ بالتحقق من التقاء الخلايا بنسبة 90٪ إلى 100٪. بعد ذلك ، قم بإزالة الوسط ، وأضف 1 ملليلتر من HBSS البارد لغسل البئر. هز اللوحة برفق وقم بإزالة HBSS دون ترك أي آثار.

في وقت لاحق ، أضف 500 ميكرولتر من محلول يحتوي على التربسين الدافئ مسبقا لفصل الخلايا عن البئر. صخري برفق ، واحتضنيه لمدة دقيقتين في حاضنة 37 درجة مئوية. بعد نقل اللوحة من الحاضنة إلى خزانة السلامة الحيوية ، قم بشفط المحلول المحتوي على التربسين أثناء الإمالة. قم بتفريقها بعناية وببطء فوق البئر عدة مرات ، حتى تنفصل الخلايا تماما.

بعد ذلك ، قم بنقل تعليق الخلية هذا إلى أنبوب معقم سعة 1.5 مليلتر ، ووضع الأنابيب في جهاز الطرد المركزي. تدور في 300 مرة جم لمدة 8 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وأعد الأنابيب إلى خزانة السلامة الحيوية. قم بإزالة المادة الطافية دون لمس الحبيبات. الآن ، قم بإعادة تعليق حبيبات الخلية بعناية عن طريق إضافة 600 ميكرولتر من وسط النمو الدافئ مسبقا وسحب العينات لأعلى ولأسفل تقريبا 30 إلى 40 مرة.