البلازما الطباعة الحجرية الزخرفة السطحية لإنشاء شبكات الخليوي

الهدف العام من التجربة التالية هو إنشاء بيئات مجهرية خلوية لدراسة الأسئلة البيولوجية المتعلقة بسلوكيات الخلايا الفردية والجماعية التي تحدث على أبعاد المقياس الميكروي والنانوي. ويتحقق ذلك أولاً من خلال تصميم قوالب ستعمل في النهاية على توجيه وضع الخلايا. بعد ذلك، يتم تحويل هذه التصاميم إلى أسطح نمطية عبر الطباعة الحجرية الضوئية (photolithography)، مما يسمح بإنشاء قوالب حماية بلازمية عبر الطباعة الحجرية اللينة (soft lithography).

أخيرًا، يتم ترتيب قوالب الحجب هذه على شكل حامل ثلاثي القوائم في طبق بتري للسماح بتعريض السطوح السفلية للبلازما بشكل انتقائي، مما يترك نمطًا كيميائيًا حساسًا للخلايا في المناطق الواقعة تحت كل قالب. ويمكن الحصول على نتائج توضح كيف يعتمد سلوك الخلية على بيئتها الدقيقة وتفاعلها مع الخلايا المجاورة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية حول تأثيرات البيئات الدقيقة على سلوك الخلايا، مثل كيف تؤثر التفاعلات بين مجموعات الخلايا على الظواهر ذات الرتب العليا؟

وكيف تؤثر الإشارات النانوية دون الخلوية على وظائف مثل الهجرة الصحية والتمايز؟ أولاً، استخدم الغراء القوي (super glue) لتثبيت شريحة ذات نمط على مجموعة من الشرائح الفارغة. بعد ذلك، اصنع حاوية من رقائق الألومنيوم تكون أكبر قليلاً من مجموعة الشرائح، وبحجم كافٍ لاستيعاب 30 grams من مادة poly dimethyl suboxane أو PDMS.

ضع مجموعة الشرائح في الحاوية، ثم صب PDMS فوق مجموعة الشرائح لإنشاء قالب أولي. بعد ذلك، قم بتفريغ الهواء من PDMS عن طريق وضع الحاوية داخل غرفة تفريغ. تخلص من أي فقاعات موجودة في PDMS عن طريق إزالة ووضع الإصبع بسرعة فوق أنبوب صمام السحب عدة مرات للسماح للهواء بالتدفق لفترة وجيزة إلى الغرفة.

يتم إغلاق الصمام لمدة خمس دقائق من عملية إزالة الغازات دون انقطاع. بعد ذلك، يُترك الـ PDMS ليتصلب داخل غطاء التدفق النظيف في درجة حرارة الغرفة لمدة تتراوح من يوم إلى يومين. وبمجرد التصلب، يتم نزع الـ PDMS من القالب الرئيسي، مما يؤدي إلى تكوين قالب صب.

بعد ذلك، صب طبقة رقيقة من ستة جرامات من الإيبوكسي المكون من جزأين، والذي تم خلطه للتو لمدة دقيقة واحدة، في القالب الرئيسي. قم بإزالة الغازات من الإيبوكسي فوراً باستخدام دورات متعددة لتكسير الفقاعات قبل أن يتصلب الإيبوكسي. بعد ترك الإيبوكسي منزوع الغازات دون تحريك لمدة ساعة، سيصل إلى مرحلة المعالجة الجزئية.

أضف المزيد من الإيبوكسي إلى القالب دون إزالة الفقاعات لإنتاج هيكل أكثر سمكاً يسهل التعامل معه في الخطوات اللاحقة. ثم اترك الإيبوكسي يتصلب لمدة تتراوح من يوم إلى يومين. وبمجرد تصلب قالب الإيبوكسي، قم بإزالته من القالب الرئيسي المصنوع من PDMS، ثم لف شريطاً لاصقاً حول قالب الإيبوكسي لتشكيل حاوية.

يمكن بعد ذلك إنشاء قالب عمل عن طريق صب PDMS فوق قالب الإيبوكسي، ثم إزالة الغازات من PDMS ومعالجة القالب الجديد لمدة تتراوح من يوم إلى يومين. بعد معالجة قالب العمل، قم بنزع القالب عن الإيبوكسي وتخزين كليهما داخل أطباق بتري في حاوية بلاستيكية محكمة الإغلاق داخل غطاء التدفق للحفاظ على النظافة. ولتحضير قالب للنمط السطحي، قم بقطع أقسام صغيرة من قالب العمل باستخدام شفرة حلاقة وضع هذه الأقسام في طبق بتري.

يتم تحديد مواقع أقسام القالب هذه على ظهر طبق Petri باستخدام قلم تحديد دائم عن طريق رسم مخطط خارجي حول أماكن استقرار أقسام القالب، ثم يتم تشكيل حامل ثلاثي من هذه الأقسام والضغط عليه لضمان التلامس المطابق بين القالب المستخدم وسطح طبق Petri. انظر إلى قاع الطبق للتأكد من دقة الوضع، وهو ما يتضح من وجود قنوات يمكن رؤيتها بالعين المجردة أو باستخدام عدسة مكبرة صغيرة. ضع المجموعة في غرفة البلازما.

ابدأ معالجة البلازما بعد عملية معالجة البلازما. قم بإزالة القالب وترتيب الأوزان وضع طبق بيتري داخل كابينة السلامة البيولوجية تحت أشعة UV لمدة 10 دقائق للتعقيم. احفظ الطبق هناك حتى يتم استزراعه بالخلايا.

قم بتخفيف الخلايا التجريبية المختارة في أوساط زراعتها القياسية لتحقيق درجة التلاقي المطلوبة. عند وضعها على سطح طبق بيتري المنقوش، صب ثلاثة ملي لتر من محلول الخلايا في طبق بيتري. قم بتحضين طبق بيتري المنقوش عند 37 °C و 5% carbon dioxide ورطوبة 100% لعدة ساعات إلى عدة أيام للسماح للخلايا بالتجمع على النمط الذي أنشأته خلية البلازما.

يتم التحقق من تكوين الأنماط باستخدام مجهر تباين الطور. عند استزراع خلايا الورم الأرومي العصبي، أضف 10 micromolar من حمض الريتينويك يومياً حتى يتم ملاحظة تمايز الخلايا إلى حالة شبيهة بالعصبونات. استبدل وسط استزراع الخلايا القياسي كل ثلاثة إلى أربعة أيام.

تتمثل النتيجة النموذجية لتطبيق تقنية الليثوغرافيا بالبلازما في تكوين نمط من الخلايا يشبه هيكلاً عشوائياً أو طبيعياً. ويمكن رؤية مثال على ذلك هنا في هذا الشكل مع عصبونات تم تمايزها باستخدام حمض الريتينويك على نمط من الخطوط. وهنا في هذا الشكل حيث تم إنشاء خطوط وشبكات من العصبونات، كما يمكن استخدام أنواع خلوية أخرى غير العصبونات كما يظهر في الشكلين التاليين؛ حيث يوضح هذا الشكل خلايا بطانية من الوريد السري البشري، ويوضح هذا الشكل خلايا عضلات هيكلية C2C12 وهي تشكل شبكات كما هو موضح هنا.

يمكن أيضاً تشكيل مواد مثل polylysine في أنماط محددة لتسهيل التصاق أنواع معينة من الخلايا ولغايات أخرى. وعقب تنفيذ هذا الإجراء، يمكن دمج مدخلات إضافية مثل الموائع الدقيقة (microfluidics)، أو سبر الخلايا، أو التعديل الجيني لبروتينات محددة، وذلك للإجابة على أسئلة إضافية، مثل كيف تؤثر مجموعات من المحفزات على سلوك الخلايا الفردية وسلوكها من الرتب العليا؟