عزل وثقافة الخلايا العصبية الدوبامين في منتصف الدماغ الجنيني الأولي

خذ أنسجة أرضية الدماغ الأوسط المعزولة من المنطقة البطنية من الدماغ الأوسط لأجنة الفئران.

الأنسجة غنية بالخلايا العصبية الدوبامين النامية ، والتي تطلق الناقل العصبي الدوبامين.

أضف محلول إنزيم لتحطيم مصفوفة الأنسجة ، وبالتالي تخفيف الخلايا.

أضف محلول مصل يحتوي على DNase I وقم بفصل الأنسجة المهضومة ميكانيكيا لتوليد تعليق الخلية. تمنع بروتينات المصل الإنزيمات ، بينما يحلل DNase I الحمض النووي خارج الخلية المنبعث أثناء تحلل الخلايا ، مما يمنع تكتل الخلايا.

دع بقايا الأنسجة تستقر وتنقل الخلايا العالقة إلى أنبوب جديد.

جهاز الطرد المركزي وإزالة المادة الطافية ، ثم إعادة تعليق الخلايا في وسط الخلايا العصبية الدوبامين ، أو DPM.

خذ صفيحة دقيقة مطلية بركيزة زراعة الخلايا في وسط الآبار ، مما يؤدي إلى إنشاء جزر صغيرة.

انقل الخلايا إلى منتصف الجزر الصغيرة لزراعتها بكثافة عالية.

احتضان ، مما يسمح للخلايا بالالتصاق بالجزر الصغيرة.

املأ الآبار ب DPM واحتضانها ، مما يسهل نمو الخلايا العصبية الدوبامينية.

لإعداد مزارع الدماغ المتوسط الجنينية الأولية من أجنة الفئران الجنينية 13.5 ، قم بتجميع جميع أرضيات منتصف الدماغ التي تم حصادها في نفس الأنبوب سعة 1.5 مليلتر ، واغسل العينات ثلاث مرات ، مع 500 ميكرولتر من HBSS الخالي من الكالسيوم والمغنيسيوم لكل غسلة. بعد الغسيل الأخير ، استبدل HBSS ب 0.5٪ تريبسين لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.

في نهاية الحضانة، أضف 500 ميكرولتر من DNase I المحضر حديثا في محلول FBS إلى الأنسجة المهضومة جزئيا واستخدم ماصة زجاجية مطلية بالسيليكون بطرف مصقول بالنار لترثيب الأنسجة. عندما يمكن ملاحظة جزيئات صغيرة فقط بالكاد مرئية ، اسمح لشظايا الأنسجة هذه بالاستقرار في قاع أنبوب الطرد المركزي الدقيق ، ونقل المادة الطافية إلى أنبوب بولي بروبيلين مخروطي فارغ سعة 15 ملليلترا.

أضف ملليلترا واحدا من HBSS إلى الأنبوب الذي يحتوي على DNase I في FBS، واخلطه عدة مرات عن طريق سحب العينات. انقل ملليلترا واحدا من هذا المحلول إلى جزيئات الأنسجة المتبقية ، وقم بتقطيع العينات مرة أخرى. بعد ذلك ، قم بتجميع معلق الخلية المهضومة مع أنبوب الطاف دون نقل أي شظايا متبقية من الأنسجة. بعد إعادة ترتيب عينة الأنسجة مرة أخرى باستخدام DNase I المتبقي في FBS في HBS ، قم بترسيب الخلايا المجمعة عن طريق الطرد المركزي ، وشفط المادة الطافية دون إزعاج الحبيبات.

اغسل الخلايا مرتين في ملليلترين من وسط الخلايا العصبية الدوبامين الدافئ لكل غسلة ، وأعد تعليق الخلايا عند 3 × 10⁴ خلايا لكل ستة ميكرولترات من تركيز متوسط دافئ طازج في أنبوب طرد مركزي دقيق. بعد ذلك ، قم بإزالة الوسط من كل جزيرة صغيرة معدة مسبقا واخلط الخلايا بسحب لطيف قبل استخدام ماصة سعة 10 ميكرولتر لإضافة ستة ميكرولترات من الخلايا إلى كل جزيرة صغيرة.

عند إضافة جميع الخلايا ، املأ الآبار الفارغة عند حواف اللوحة ب 150 ميكرولتر من الماء أو PBS ، وضع اللوحة في حاضنة زراعة الخلايا لمدة ساعة واحدة. في نهاية الحضانة ، أضف 100 ميكرولتر من وسط الخلايا العصبية الدوبامين الطازجة إلى كل بئر ، وأعد اللوحة إلى الحاضنة.