موسوعة JoVE للتجارب
علم الأعصاب
0 مشاهدة • 3:29 دقيقة • July 8th, 2025
خذ الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة البشرية ، أو iPSC ، مستعمرات مستزرعة على صفيحة مغلفة بالمصفوفة خارج الخلية.
يتم تعديل iPSCs وراثيا للتعبير عن عوامل النسخ التي تحفز تمايز الخلايا العصبية الحركية.
قم بإزالة الوسائط وإضافة الإنزيمات لفصل المستعمرات.
قم بفصل الخلايا ميكانيكيا في معلق أحادي الخلية وجمعها.
جهاز الطرد المركزي وإزالة المادة الطافية.
أعد تعليق الخلايا في الوسائط التي تحتوي على مثبط يمنع موت الخلايا المبرمج الخلوي.
ضع الخلايا في طبق مغطى بالمصفوفة.
أضف وسائط تمايز جديدة تحتوي على المضاد الحيوي دوكسيسيكلين ومثبطات الجزيئات الصغيرة.
الدوكسيسيكلين يحفز التعبير عن عامل النسخ, في حين أن المثبطات منع مسارات إشارات محددة, تعزيز تمايز iPSC إلى أسلاف الخلايا العصبية الحركية.
أضف الإنزيمات لفصل الخلايا.
اجمع الخلايا وفصلها ميكانيكيا.
جهاز الطرد المركزي والتخلص من المادة الطافية. أعد تعليق الخلايا في الوسط العصبي.
ضع الخلايا على شرائح دقيقة مطلية بالبروتين اللاصق لتعزيز التصاق الخلايا.
تحفز عوامل النمو في الوسائط نضوج السلف في الخلايا العصبية الحركية.
لتمايز الخلايا العصبية الحركية ، قم بفصل مزارع الخلايا المنقولة بثبات مع كاشف التفكك كما هو موضح للسماح بجمع الخلايا في أنبوب سعة 15 مليلتر يحتوي على 5 أحجام من وسط DMEM / F12. بعد الطرد المركزي ، قم بإعادة تعليق الخلايا في وسط iPSC البشري المكمل بمثبط الصخور الدقيقة للعد.
قم بزرع الخلايا في أطباق مغلفة بالمصفوفة بكثافة 6.25 × 104 خلايا لكل سنتيمتر مربع. خلال اليومين التاليين ، استبدل المواد الطافية بوسط تمايز جديد مكمل بالدوكسيسيكلين.
في اليوم الثاني ، قم بتغيير الوسط إلى وسط B27 العصبي المكمل بمثبط جاما سيكريتيز ، ومثبط مستقبلات عامل النمو البطاني الوعائي ، والدوكسيسيكلين. في اليوم الخامس ، قم بفصل الخلايا كما هو موضح ، وأعد تعليق الخلايا المنفصلة في 4 ملليلتر من وسط DMEM / F12 للعد.
سحب العينات مهم للتفكك الكامل للخلايا.
قم بتجميد حصة من أسلاف الخلايا العصبية الحركية في وسط تجميد الخلايا وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، واجمع باقي الخلايا عن طريق الطرد المركزي. أعد تعليق الحبيبات في وسط عصبي مكمل ب 10 مثبطات ميكرومولار روك.
قم بزرع الخلايا على دعامات الشرائح الدقيقة المطلية بالبولي أورنيثين مع أغطية بوليمر بكثافة 1 × 105 خلايا لكل سنتيمتر مربع. في اليوم السادس ، استبدل الوسط بعناية بوسط عصبي جديد بدون مثبط للزراعة حتى تحليل المصب دون فصل الخلايا عن سطح الدعم.