JoVE Encyclopedia of Experiments
علم الأعصاب
0 مشاهدات • 2:57 د • July 8th, 2025
خذ خلايا العقدة الشبكية لسمك الزرد المستزرعة على أغطية مغلفة.
تعبر هذه الخلايا عن مستشعر حيوي مشفر وراثيا ينتج بروتين الفلورسنت الأخضر الحساس للأكسدة والاختزال roGFP2 المدمجة في إنزيم حساس لبيروكسيد الهيدروجين ، Orp1.
انقل الغطاء بالوسائط إلى غرفة تصوير الخلايا الحية وضع الغرفة على مجهر مقلوب.
استبدل الوسائط بوسائط خالية من المصل لتقليل تألق الخلفية.
نظرا لانخفاض مستويات بيروكسيد الهيدروجين ، يظل roGFP2 في شكله المنخفض.
قم بإثارة المستشعر الحيوي بالتتابع عند الأطوال الموجية 405 و 480 نانومتر.
يظهرroGFP2 المخفض ذروة إثارة عند 480 نانومتر.
قم بالتبديل إلى وسائط تحتوي على بيروكسيد الهيدروجين.
يدخل بيروكسيد الهيدروجين إلى الخلايا ويتفاعل مع Orp1 ، ويؤكسد roGFP2.
قم بإثارة المستشعر الحيوي مرة أخرى.
يظهرroGFP2 المؤكسد زيادة مضان عند 405 نانومتر وانخفاضا عند 480 نانومتر.
احسب نسبة شدة التألق.
تشيرالزيادة في النسبة إلى زيادة مستويات بيروكسيد الهيدروجين الخلوي.
في يوم التصوير ، افحص الخلايا تحت المجهر للتحقق من نمو محاور RGC. لتصوير الخلايا الحية، انقل الغطاء من طبق المزرعة إلى غرفة تصوير الخلايا الحية. استخدم مجهرا مقلوبا مزودا بهدف DIC ومرشح أحمر طويل التمرير OG590 وكاميرا EM-CCD.
قبل التصوير ، استبدل وسيط ZFCM + ب ZFCM-. بعد وضع الخلايا بهدف 10x ، احصل على صور بتكبير 60x باستخدام هدف الغمر بالزيت. استخدم تكبيرا إضافيا بمقدار 1.5x.
أولا ، احصل على صور DIC ، ثم الصورة roGFP2-Orp1 باستخدام مجموعة مرشحات مناسبة. بعد التقاط المجموعة الأولى من الصور ، تبادل الوسائط مع الوسائط التي تحتوي على حلول معالجة مختلفة. يجب تغيير الوسائط كل 30 دقيقة من التصوير لتجنب تغيرات الأس الهيدروجيني والأسمولية.