التسجيلات الفيزيولوجية الكهربية لتقييم التجديدات العصبية في شرائح الحبل الشوكي المزروعة المشتركة

خذ مصفوفة متعددة الأقطاب الكهربائية المطلية بالبوليمر أو MEA ، مع شرائح الحبل الشوكي الجنينية المستزرعة بشكل مشترك موضوعة في منطقتين منفصلتين ، مما يسمح بالتسجيل المتزامن من كلتا الشريحتين.

تظهر الشريحة الروابط العصبية المتجددة في المنطقة الآفة السابقة.

ضع MEA في غرفة تسجيل تحتوي على محلول خارج الخلية غني بالأيونات والمواد المغذية للحفاظ على بقاء الخلايا العصبية.

السماح للنظام بالاستقرار ، مما يسهل تكيف الخلايا العصبية والتواصل.

تتواصل الخلايا العصبية عبر إشارات كهربائية تسمى إمكانات الفعل ، والتي يتم تسجيلها بواسطة الأقطاب الكهربائية القريبة في منطقة الشرق الأوسط وأفريقيا.

يتم الجمع بين الإشارات الفردية من كل قطب كهربائي ، مما ينتج عنه إشارة كهربائية من كل شريحة.

استبدل المحلول خارج الخلية بانتظام للحفاظ على استقرار الخلايا العصبية.

أضف محلولا خارج الخلية مع مثبطات تمنع مستقبلات الناقل العصبي المثبطة على الأغشية العصبية ، مما يحافظ على نشاط الخلايا العصبية لفترة أطول.

قارن النشاط الكهربائي من كلتا الشريحتين. تؤكد الإشارة الكهربائية المتزامنة بين الشريحتين الوصلات المشبكية والتجديد العصبي الناجح.

ضع طبق بتري مع مجموعة أقطاب كهربائية دقيقة مطلية بالداخل تحت مجهر مجسم. اجعل المصفوفة في التركيز ، وقم بتوسيط قطرة من ستة ميكرولتر من بلازما الدجاج على مجموعة الأقطاب الكهربائية. باستخدام ملعقة صغيرة ، حرك قسمين من الحبل الشوكي بحذر بحيث يكون جانبهما البطني مواجها لبعضهما البعض في قطرة البلازما.

بعد ذلك ، أضف ثمانية ميكرولترات من الثرومبين حول قطرة بلازما الدجاج. بعد ذلك ، استخدم طرف الماصة لخلط ونشر خليط بلازما الدجاج والثرومبين بعناية. قبل أن يصبح خليط بلازما الدجاج والثرومبين خيطيا جدا ويبدأ في التخثر ، استنشق السائل الزائد. ثم غطي طبق بتري وضعيه في غرفة رطبة.

ضع الغرفة داخل حاضنة على حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعة تقريبا. بعد الحضانة ، أضف بعناية 10 ميكرولتر من وسط المغذيات إلى العينة. غطي طبق بتري وضعيه مرة أخرى في الحاضنة لمدة 45 دقيقة إضافية. بعد ذلك ، ضع كل مجموعة من مجموعات ثقافة المصفوفة متعددة الأقطاب الكهربائية في أنبوب أسطواني وأضف ثلاثة ملليلتر من وسط المغذيات. أغلق الغطاء بإحكام وضع أنبوب الأسطوانة في أسطوانة الأسطوانة. قم بتدوير الأسطوانة بسرعة 1 إلى 2 دورة في الدقيقة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية.

باستخدام ملقط معقم ذو رؤوس مطاطية ، قم بإزالة مجموعات ثقافة المصفوفة متعددة الأقطاب الكهربائية من أنبوب الأسطوانة وضعها في طبق بتري تحت مجهر مجسم. اجعل الأنسجة في بؤرة التركيز وتحقق من اندماج الشريحتين. بعد ذلك ، أمسك التجميع بثبات وضع شفرة مشرط في أخدود مجموعة الأقطاب المتعددة بالقرب من شرائح الأنسجة. أمسك المشرط أفقيا إلى حد ما ثم ارفع مقبض المشرط لأعلى ، لكن اترك شفرة المشرط تبقى في أخدود المصفوفة بحيث تتدحرج الشفرة من القاعدة إلى الحافة ، وتقطع الأنسجة ، وتغطي الأخدود.

اقطع أي وصلات أنسجة متبقية بطرف إبرة قياس 25 إذا لزم الأمر. اعمل فقط في المنطقة الموجودة داخل الأخدود ، ولا تلمس حواف العطاء. ضع مجموعات ثقافة المصفوفة متعددة الأقطاب الكهربائية مرة أخرى في أنبوب الأسطوانة وأضف ثلاثة ملليلتر من وسط المغذيات الطازجة إلى الثقافات. ثم ضع أنبوب الأسطوانة مرة أخرى على أسطوانة الأسطوانة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية.

قم بتركيب مجموعة ثقافة مصفوفة متعددة الأقطاب الكهربائية في غرفة التسجيل وقم بتطبيق حوالي 500 ميكرولتر من المحلول خارج الخلية على المصفوفة. ثم قم بتركيب التجميع على المجهر. انتظر 10 دقائق حتى يستقر النظام ، ثم سجل النشاط التلقائي الأساسي من كل قطب من أقطاب الكشف عن النشاط لمدة 10 دقائق. كرر التسجيلات مرتين.

لضمان ظروف مستقرة خارج الخلية ، قم بتبديل المحلول خارج الخلية بعد كل جلسة تسجيل. إذا رغبت في ذلك ، قم بإلغاء تثبيط الشبكة عن طريق تطبيق محلول خارج الخلية يحتوي على ميكرومولار واحد من الإستركنين و 10 ميكرومولار من الجابازين وانتظر لمدة دقيقتين على الأقل قبل تسجيل النشاط الكهربائي.