نهج غير جراحي لدراسة الفيزيولوجيا الكهربية للخلايا العصبية الحركية في أجنة أسماك الزرد

ضع أجنة الزرد المعدلة وراثيا تحت مجهر مجسم ولاحظ الالتفاف التلقائي للذيل الذي تسببه الخلايا العصبية الحركية للحبل الشوكي.

تتسبب الخصائص الجوهرية لهذه الخلايا العصبية في تدفق الأيونات عبر قنوات الصوديوم ، مما يؤدي إلى إزالة الاستقطاب الغشائي التلقائي وتوليد إمكانات الفعل التي تنتشر إلى العضلات ، مما يؤدي إلى لف الذيل. قياس تردد اللف.

نقل بعض الأجنة إلى حاصرات قناة الصوديوم لمنع تدفق الصوديوم وتقييم تردد اللف المنخفض.

قم بتركيب الأجنة غير المعالجة في الاغاروز المنصهر ؛ دع الاغاروز يتجمد لتقييد الحركة ، وراقب تحت المجهر الفلوري.

تعبر الخلايا العصبية الحركية عن مستشعر حيوي مع مجال استشعار الجهد المرتبط بالغشاء ، أو VSD ، مدمج مع الفلوروفورات المانحة والمتقبلة.

يغير إزالة الاستقطاب شكل VSD ، مما يجعل الفلوروفورات أقرب

عند الإثارة ، ينقل المتبرع الطاقة إلى المستقبل ، مما يتسبب في انبعاث مضان المستقبل.

أضف الحاجز لتثبيط إزالة الاستقطاب ، مما يقلل من انبعاث المستقبل ، مما يؤكد تثبيط إزالة الاستقطاب التلقائي في الخلايا العصبية.

لتحليل لف الذيل التلقائي ، انقل الأجنة إلى طبق بتري دائري مقاس 90 ملم مملوء بماء السمك يحتوي على 0.2٪ DMSO ، وقم بفك الكشط يدويا باستخدام ملقطين من صائغ بأطراف أو إبر حادة. بعد ذلك ، احتضن الأجنة لمدة 5 دقائق عند 28 درجة مئوية. باستخدام كاميرا رقمية مثبتة على مجهر مجسم، اكتشف لف الذيل في درجة حرارة الغرفة أثناء تسجيل فيديو مدته دقيقة واحدة.

بعد ذلك ، احصل على السلسلة الزمنية بدقة زمنية تبلغ 30 إطارا في الثانية. بعد ذلك ، احسب تكرار لف الذيل التلقائي عن طريق حساب عدد الانحناءات لكل وحدة زمنية. لتقييم تأثير عقار ريلوزول ، انقل الأجنة إلى طبق بتري جديد مقاس 90 ملم مملوء بماء السمك يحتوي على 5 ميكرومولار ريلوزول. بعد ذلك ، احتضان الأجنة لمدة 5 دقائق عند 28 درجة مئوية قبل تسجيل مقطع فيديو مدته دقيقة واحدة وإجراء التحليل السلوكي.

الآن ، قم بتركيب أجنة 20 إلى 24 HPF في 1٪ من نقطة انصهار منخفضة في مياه السمك داخل طبق تصوير ذو قاع زجاجي مقاس 35 ملم عند 37 درجة مئوية. قم بتوجيه الأجنة على جوانبها وانتظر حتى يتجمد الاغاروز في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، انقل طبق التصوير إلى مرحلة المجهر متحد البؤر. تحديد الخلايا العصبية الحركية التي تعبر عن المستشعر الحيوي عن طريق Umikinoko-Green الأحادي المثير باستخدام ليزر الأرجون 488 نانومتر. ثم اضبط انبعاثها بين 495 و 525 نانومتر واضغط على سجل.

لقياس FRET ، قم بإثارة mUKG ، المتبرع لزوج FRET بليزر 488 نانومتر. في الوقت نفسه ، باستخدام اثنين من المضاعفات الضوئية ، اكتشف التألق المنبعث من المتبرع والتألق المنبعث من متقبل Kusabira-Orange الأحادي. في بداية التجربة ، قم بتحسين كسب وإزاحة المضاعف الضوئي 1 ، حيث يتم تسجيل مضان mUKG ، واحتفظ بها ثابتة طوال الجلسة.

لتعيين الإزاحة، قم بتغيير لون الصورة إلى قيم الكثافة باستخدام جدول Q-lookup. أثناء المسح الضوئي مع إيقاف تشغيل الليزر، استخدم شريط تمرير الإزاحة بحيث تكون كثافة وحدات بكسل الخلفية أعلى قليلا من الصفر. باستخدام نفس جدول البحث ، قم بتشغيل الليزر. أثناء المسح الضوئي ، استخدم شريط تمرير الكسب لزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء إلى أقصى حد ، مع الحرص على تجنب وحدات البكسل المشبعة.

في نافذة الحصول على البرامج، حدد وضع اكتساب xyt وحجم حقل صورة يبلغ 512 × 64 بكسل من القائمة المنسدلة. بعد ذلك ، اضبط تسجيل التغييرات في جهد الخلايا العصبية الشوكية للجنين للحصول على مستوى xy واحد كل 30 مللي ثانية لمدة دقيقة واحدة. تقييم تأثير إعطاء الريلوزول على إزالة الاستقطاب الغشائي في نفس الخلية العصبية ، والحصول على مجموعة بيانات جديدة بعد خمس دقائق من إضافة ماء السمك الذي يحتوي على 5 ميكرومولار ريلوزول.