موسوعة JoVE للتجارب
علم الأعصاب
0 مشاهدة • 4:08 دقيقة • July 8th, 2025
ابدأ بزرع السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي أو aCSF فوق شبكة شبكية في غرفة التروية.
انقل شريحة دماغية تحتوي على خلايا عصبية تعبر عن البروتين الفلوري وقم بتثبيتها بجهاز سلكي بالبلاتين.
قم بتدوير الشبكة للمحاذاة.
اخفض المسبار متعدد القنوات باتجاه الشريحة.
اضبط مكعب المرشح لتصور بروتين الفلورسنت.
قم بتدوير الشريحة لمحاذاة المسبار.
اضبط ارتفاع المسبار تحت سطح الأنسجة.
الآن ، قم بدمج aCSF والتركيز على الخلايا العصبية المسماة بالفلورسنت.
باستخدام هدف عالي الطاقة ، ركز على الأنسجة واضبط ضوء الإثارة.
استخدم مرشح ضوئي مناسبا لمراقبة التألق في الخلايا العصبية.
اضبط العدسة الموضوعية لتوفير مساحة لماصة التصحيح والضغط الإيجابي.
بعد ذلك ، ضع الماصة بالقرب من الخلية العصبية لتشكيل غشاء.
أخيرا ، قم بتطبيق شفط ضعيف لإنشاء ختم غشائي ، متبوعا بشفط قوي لكسر الغشاء والحصول على تسجيلات كهربائية من الخلايا العصبية المستهدفة.
لوضع المسبار متعدد القنوات في شريحة أنسجة المخ خارج الجسم الحي ، قم بنشر ACSF التجريبي بمعدل ثلاثة إلى ستة ملليلتر في الدقيقة ، وانقل شريحة الدماغ التي تحتوي على منطقة الاهتمام إلى الشبكة الشبكية في غرفة التروية المجهرية. قم بتثبيت شريحة الدماغ بقيثارة بلاتينية. قم بتدوير شبكة الشبكة بحيث يكون خط ملامسات القطب الكهربائي على الطرف البعيد للمسبار متعدد القنوات عموديا تقريبا على سطح PL.
تحت إضاءة المجال الواسع والتحكم الدقيق في المعالج الدقيق ، قم بخفض المسبار متعدد القنوات باتجاه سطح الشريحة. قم بتشغيل مكعب المرشح المناسب لتصور بروتين مراسل الفلورسنت المعبر عنه في المحطات المحورية للوافدين القشريين.
إذا لزم الأمر ، قم بتدوير الشريحة لمحاذاة المسبار بدقة أكبر مع سطح PL. ضع المسبار فوق مستوى الشريحة مباشرة ، على بعد 200 ميكرومتر من موضع الهدف النهائي على طول المحور x ، مع ترك قناة واحدة على الأقل خارج منطقة الأنسجة التي يتم تسجيلها. ببطء ، أدخل المسبار في الشريحة على طول محورها الطولي.
لتقليل الضرر الذي يلحق بالأنسجة ، قم بتقدم المسبار فقط إلى الحد الذي تكون فيه الأطراف الحادة مرئية أسفل سطح الأنسجة. قم بتبديل مصدر ACSF التجريبي إلى حل التحكم المعبأ في أكياس ، وحدد الخلية ذات العلامات الفلورية لتسجيل مشبك التصحيح المستهدف. قم بتقييد الفتحة إلى أصغر قطر، وقم بإشراك هدف الغمر في الماء عالي الطاقة، مع الحرص على تجنب التلامس بين المسبار متعدد القنوات والعدسة الموضوعية. اجعل الأنسجة في بؤرة التركيز.
قم بتوسيط الضوء على منطقة من الأنسجة المجاورة للمسبار متعدد القنوات ، ولكن لا يتداخل معه. قم بتشغيل مجموعة المرشحات المناسبة للسماح بتصوير الخلايا التي تعبر عن علامة الفلورسنت المعتمدة على Cre. ارفع العدسة الموضوعية لتوفير مساحة واسعة لخفض ماصة التصحيح.
قم بتحميل ماصة رقعة بمحلول داخلي وتركيبها على حامل القطب. استخدم حقنة سعة مليلتر واحد لتطبيق ضغط إيجابي يعادل حوالي 0.1 ملليلتر من الهواء. قم بخفض ماصة التصحيح في المحلول، مع التركيز على الطرف تحت التوجيه البصري، والحصول على تسجيل خلية كاملة من الخلية المستهدفة.