موسوعة JoVE للتجارب
علم الأعصاب
0 مشاهدة • 4:35 دقيقة • July 8th, 2025
خذ شريحة شبكية ماوس مكيفة مع الظلام داخل غرفة تسجيل في غرفة مظلمة. تجلس شبكية العين على قاعدة اصطناعية داعمة موضوعة فوق زلة غطاء. قم بتدمير الشريحة باستخدام aCSF.
تشتمل الشبكة العصبية الشبكية على مستقبلات ضوئية مرتبطة بشكل متشابك مع الخلايا ثنائية القطب التي تتشابك مع الخلايا العقدية.
ضع ماصة تسجيل بالقرب من شبكية العين.
تحت المجهر ، قم بالضغط الإيجابي أثناء الاقتراب من خلية عقدية مستهدفة.
قم بالتبديل إلى الضغط السلبي لسحب رقعة الغشاء ، ثم قم بتمزيقها لتأسيس الاستمرارية مع السيتوبلازم.
في الظلام ، يظل غشاء المستقبلات الضوئية مزيل الاستقطاب ، مما يؤدي إلى إطلاق الناقل العصبي.
تؤديالناقلات العصبية المرتبطة بمستقبلات الخلايا ثنائية القطب إلى إغلاق القناة الكاتيونية ، مما يثبط نقل الإشارة.
ضع نبضة ضوئية لفرط استقطاب المستقبلات الضوئية. يؤدي انخفاض إطلاق الناقل العصبي إلى فتح القناة الكاتيونية في الخلايا ثنائية القطب.
يحفز تدفق الكاتيون إطلاق الناقل العصبي الذي يرتبط بمستقبلات الخلايا العقدية ، مما يولد إمكانات ما بعد التشابك المثير التي تسجلها الماصة.
بالنسبة لتسجيلات المشبك التصحيح ، قم بتجهيز أنابيب التروية بوسيط أميس واسمح لجميع الفقاعات بالمرور من الأنبوب. بعد عمل ماصات التسجيل باستخدام مجتذب زجاجي، قم بإعادة ملء الحافة بمحلول الماصة. بعد ذلك، استخدم حشو الماصة الدقيقة لملء حوالي ثلث الماصة. بمجرد ملئها، قم بتخزين كل ماصة في صندوق ماصة رطب.
بعد ذلك ، قم بتشغيل الجهاز لتسجيلات مشبك التصحيح ، بما في ذلك الكمبيوتر ومكبر الصوت وكاميرا CCD والمجهر. العمل في الظروف المظلمة ، ضع شريحة الشبكية على مرحلة المجهر بمساعدة عارض الأشعة تحت الحمراء. بعد تجميدها ، ابدأ التروية المستمرة.
اضبط درجة حرارة التروية على 33 إلى 37 درجة مئوية. اعرض سطح الشريحة بكاميرا CCD. ركز على الموقع المستهدف حيث توجد أنواع الخلايا المستهدفة. حدد خلية ذات مظهر صحي لتسجيل مشبك التصحيح. بمجرد تحديد الخلية السليمة، ضع ماصة تسجيل في حامل الماصة، وقم بدفع الماصة إلى تحضير الشريحة.
عندما تكون قريبة من تحضير الشريحة ، ابحث عن طرف الماصة بالمجهر. بمجرد أن يصبح طرف الماصة مرئيا تحت المجهر ، حرك الطرف لأسفل باتجاه الخلية المستهدفة. بعد ذلك، اضبط مكبر الصوت، واضبط الماصة عند بيكوأمبير 5 فولت لكل نانوأمبير. ابدأ نبضتين كهربائيتين متواصلتين بحوالي 5 مللي فولت وحوالي 10 هرتز وتحقق من مقاومة الماصة.
تتراوحالمقاومة المثالية بين 5 و 12 ميغا أوم لمعظم الخلايا العصبية في الشبكية. عندما تصبح جاهزا ، استخدم لسان حال أو حقنة لتفجير المحلول الداخلي ، حتى يصبح طرف الماصة على سطح الخلية المستهدفة. عندما يتسبب الضغط الإيجابي في ظهور غمازة صغيرة على سطح الخلية ، قم بتقديم الطرف قليلا وتوقف عن النفخ.
إذا كانت مقاومة الماصة تتزايد باستمرار، فاتركها وراقب المقاومة حتى تصل إلى أكثر من 1 جيجا أوم. إذا لم تزداد المقاومة تلقائيا ، فقم بالضغط السلبي برفق حتى يصبح جيجاسيل. بعد تحقيق الجيجاسيل ، قم بتغيير جهد الاحتفاظ إلى سالب 70 مللي فولت.
بعد ذلك، قم بالضغط السلبي بشكل متقطع لتمزق الغشاء داخل طرف الماصة. عند إجراء تكوين الخلية بأكملها ، يمكن أن تتراوح مقاومة الماصة بين 500 ميغا أوم وجيجاأوم واحد ، ويمكن ملاحظة التيار السعوي. سجل علاقة IV من سالب 80 إلى 40 مللي فولت. سيتم تنشيط أنواع مختلفة من القنوات ذات الجهد الكهربائي اعتمادا على نوع الخلية. أخيرا ، سجل التيارات أو الفولتية المشبكية التي يثيرها الضوء.