تثبيط MicroRNA بوساطة التيارات المثيرة بعد المشبكي في شرائح الحصين الفأر

خذ شرائح دماغ الحصين الفأرية التي تحتوي على الخلايا العصبية CA3 المصابة بناقل فيروسي مؤتلف.

يعبر الجينوم الفيروسي عن قناة يتم تنشيطها بالضوء وعلامة بمراسل فلورسنت وميكرو RNA يقلل من تنظيم التعبير عن قنوات الكالسيوم ذات الجهد الكهربائي.

ضع شريحة في غرفة التسجيل في ظروف مظلمة. باستخدام المجهر ، حدد الخلايا العصبية CA3 الفلورية.

قم بتصحيح قطب تسجيل على خلية عصبية CA1 تتلقى مدخلات من الخلايا العصبية CA3 المصابة. تمزق الغشاء لتسجيل التيارات الأيونية داخل الخلايا.

تطبيق مثبط لمنع مستقبلات الناقل العصبي المثبطة, السماح فقط الإشارات مثيرة.

باستخدام نبضات الضوء ، قم بتحفيز القنوات التي يتم تنشيطها بالضوء في الخلايا العصبية CA3 المصابة ، مما يولد إمكانات العمل.

في الفئران غير المصابة ، ينشط جهد الفعل قنوات الكالسيوم ذات الجهد الكهربائي ، مما يتسبب في تدفق أيونات الكالسيوم التي تؤدي إلى إطلاق الناقل العصبي. تؤدي الناقلات العصبية إلى تشغيل تيارات ما بعد المشبكي المثيرة ، أو EPSCs ، في الخلايا العصبية CA1.

في الفئران المصابة ، يؤدي التقليل بوساطة الحمض النووي الريبي الصغير لقنوات الكالسيوم ذات الجهد الكهربائي إلى تثبيط EPSC.

بالنسبة لهذا البروتوكول ، استخدم تم حقن rAAV1 / 2 في الدماغ قبل 15 يوما أو أكثر ، وفقا لبروتوكول نشر سابقا من قبل Cetin وشركاه. اعزل الدماغ وعمل شرائح دماغية حادة باستخدام aCSF الاهتزازي والغاز المثلج.

اجمع شرائح المنطقة محل الاهتمام ، وقلل من تعرضها للضوء لتجنب تنشيط المسبار البصري الوراثي. دع الشرائح تتعافى لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في نفس aCSF. استخدم غرفة مصممة خصيصا لحمل شرائح الدماغ. بعد ذلك ، أعد الشرائح إلى درجة حرارة الغرفة حيث ستبقى صحية لمدة ست إلى ثماني ساعات.

للمتابعة ، انقل شريحة إلى غرفة التسجيل ، وقم بدمجها بشكل فائق بمعدل ملليلترين في الدقيقة من aCSF. بعد ذلك ، تحقق لفترة وجيزة من إشارة مراسل الفلورسنت المعبر عنه للتأكد من توطين وشدة العدوى. ثم املأ قطبا كهربائيا بالمحلول داخل الخلايا.

الآن ، تحت إضاءة الأشعة تحت الحمراء ، احصل على تكوين خلية كاملة محكمة الغلق على خلية عصبية تتلقى مدخلات متشابكة من الخلايا العصبية المصابة. يمكن ترك مقاومة السلسلة دون تعويض ، ولكن يجب أن تكون ثابتة ومنخفضة. على سبيل المثال ، إذا أصيبت الخلايا العصبية الهرمية CA3 ، فقم بتصحيح الخلايا العصبية الهرمية في السبيل الإنسي القريب إلى الإنسي لمنطقة CA1.

عندما تبدأ الخلايا في الظهور بمظهر منكمش أو منتفخ ، عندما يصبح الترقيع صعبا أو تكون البقع غير مستقرة ، فإن الشرائح المحددة ليست صحية لفترة كافية للتسجيل منها.

بعد ذلك ، استخدم علم الأدوية لعزل التيارات المشبكية قيد التحقيق. على سبيل المثال ، إذا كان الهدف هو التحقيق في الانتقال المشبكي الاستثاري ، فقم بمنع الانتقال المشبكي المثبط عن طريق إضافة bicuculline إلى الحمام.

بعد ذلك ، استحضر التيارات المشبكية مثل التيارات المثيرة بعد المشبكي باستخدام ليزر أزرق 473 نانومتر مقترنا بألياف ضوئية موضوعة على سوماتا الخلايا العصبية المصابة. لا توجه الليزر إلى محاور الخلايا العصبية.

على سبيل المثال ، تجنب تسليط الضوء على ضمانات شافر. إزالة الاستقطاب المباشر للمحاور غير مرغوب فيه. بعد ذلك ، اضبط طول التحفيز إلى الحد الأدنى لتقليل إمكانية استحضار أكثر من جهد فعل واحد لكل نبضة ضوئية.

بعد ذلك ، قم بتحسين شدة الليزر لاستحضار تيار متشابك صغير ولكن يمكن اكتشافه بوضوح. على سبيل المثال ، بالنسبة للانتقال المشبكي الاستثاري بين الخلايا العصبية الهرمية CA3 و CA1 ، اضبط شدة الليزر لاستحضار التيارات المشبكية من 20 إلى 50 بيكوأمبير.