تسجيل النشاط الفيزيولوجي الكهربي للشبكة العصبية في الزراعة المشتركة بين الخلايا العصبية والخلايا النجمية

ابدأ بصفيف متعدد الأقطاب الكهربائية ، أو لوحة MEA. يحتوي كل بئر على مجموعة من الأقطاب الكهربائية في موقع مركزي.

المصفوفة مطلية بركيزة مزرعة لتسهيل التصاق الخلية.

أضف تعليقا للخلايا العصبية الحركية والخلايا النجمية كقطرة فوق المصفوفة.

احتضن للسماح بارتباط الخلية ، ثم أضف وسط زراعة مشترك دافئ مكمل بجزيء صغير يحافظ على بقاء الخلية.

أثناء الحضانة ، تفرز الخلايا النجمية العوامل التي تعزز نضوج الخلايا العصبية وتكوين المشبك ، مما يؤدي إلى شبكة عصبية.

ضع MEA في جهاز تسجيل في ظروف فسيولوجية لمراقبة النشاط العصبي.

تنقل الخلايا العصبية إشارات كهربائية ، تسمى إمكانات الفعل ، والتي تنتقل على طول محاورها.

عند الوصول إلى المشبك ، تؤدي الإشارة إلى إطلاق الناقل العصبي ، مما يؤدي إلى نشر الإشارة إلى الخلية العصبية التالية.

تسجل الأقطاب الكهربائية داخل كل بئر خارج الخلية الإشارات الناتجة عن الخلايا العصبية المتصلة متشابكيا.

يؤكد اكتشاف الإشارات الكهربائية الإيقاعية المتزامنة إنشاء شبكة عصبية.

في يوم الطلاء أو قبله ، ابدأ في طلاء ألواح MEA المكونة من 24 بئرا عن طريق تخفيف PLO أولا في الماء أو PBS. بعد ذلك ، أضف 15 إلى 20 ميكرولترا من PLO إلى كل بئر ، لتشكيل قطرة في وسط البئر ، تغطي منطقة القطب ، مع ضمان عدم إتلاف الأقطاب الكهربائية بطرف الماصة.

أضف الماء إلى الآبار المحيطة بالمقصورات ، مما يضمن الرطوبة الكافية ، واحتضان منظمة التحرير الفلسطينية عند 37 درجة مئوية لمدة 1 إلى 2 ساعة. بعد ذلك، باستخدام طرف ماصة بلاستيكية دقيقة، قم بشفط أكبر قدر ممكن من منظمة التحرير الفلسطينية دون لمس الأقطاب الكهربائية. بعد ذلك ، اغسل البئر ب 250 ميكرولتر من الماء ثلاث مرات.

باستخدام طرف الماصة ، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الماء واترك السطح يجف مع إزالة الغطاء. بعد ذلك ، أضف 15 إلى 20 ميكرولترا من اللامينين المخفف لتغطية كل مجموعة قطب. بعد إضافة الماء إلى حجرات الرطوبة واستبدال الغطاء ، احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين على الأقل حتى ليلة وضحاها.

في يوم الطلاء ، بعد شطف الخلايا العصبية الحركية ومزارع الخلايا النجمية مرة واحدة باستخدام PBS ، أضف 0.05٪ تربسين واحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق تقريبا لرفع الخلايا. اجمع الخلايا في أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر ، يحتوي على مثبط التربسين ، واغسل الألواح بوسط أو قاعدة لضمان جمع جميع الخلايا.

قم بعمل حبيبات أسفل الخلايا عن طريق الطرد المركزي ، ثم باستخدام ماصة سعة 1,000 ميكرولتر ، وأعد تعليق الخلايا العصبية الحركية والخلايا النجمية بوسط زراعة مشترك يحتوي على 20 ميكرومولار من مثبطات ROCK لتوليد 1 مليلتر من معلق أحادي الخلية. باستخدام مقياس الدم ، قم بحساب الخلايا العصبية الحركية والخلايا النجمية ، وأثناء العد ، قم بتغطية معلقات الخلية وضعها في رف الستايروفوم عند 4 درجات مئوية.

جهاز طرد مركزي 1 ملليلتر من كلا المعلقين الخلية عند 300 مرة غرام لمدة 5 دقائق. احسب الحجم المطلوب ، وأعد تعليق الكريات. اجمع بين الحجم المطلوب من تعليق الخلايا العصبية والخلايا النجمية بنسب متساوية ، واخلطه برفق عن طريق سحب العينات مرتين للاندماج جيدا.

بعد ذلك ، قم بإزالة اللامينين من كل بئر من اللوحة وانقل 10 ميكرولترات من تعليق الخلية النهائي المدمج إلى كل بئر ، لتشكيل قطرة صغيرة تغطي مجموعة القطب. احتضان الصفائح بقطرة خلية غير مضطربة عند 37 درجة مئوية لمدة 20 إلى 30 دقيقة لتشكيل مرفقات أولية على الألواح.

بعد ذلك، قم بتعبئة 250 ميكرولتر من وسائط الزراعة المشتركة الدافئة التي تحتوي على مثبط ROCK لأسفل على جدار كل بئر، وقم بوضع الماصة بنفس الحجم على الجدار المقابل لكل بئر، واحتضان الصفيحة عند 37 درجة مئوية لمدة 24 إلى 36 ساعة. في اليوم التالي ، افحص الصفائح بحثا عن الحطام أو الخلايا الميتة ، وإذا لزم الأمر ، استبدل الوسط بوسط زراعة مشترك جديد يحتوي على مثبط ROCK.

خلاف ذلك ، قم بإجراء تبادلات نصف متوسطة مرتين في الأسبوع باستخدام وسيط زراعة مشتركة بدون مثبط ROCK ، بدءا من يوم الزراعة المشتركة 2. لإجراء التسجيل ، ابدأ في أقرب وقت ممكن بعد يوم الزراعة المشتركة 1 عن طريق ضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية وثاني أكسيد الكربون على 5٪. بعد ذلك ، انقل اللوحات إلى جهاز التسجيل ، وقم بالتوازن لمدة خمس دقائق على الأقل قبل التسجيل. سجل نشاط خط الأساس كل يومين أو أسبوعيا على مدار 1 إلى 15 دقيقة ، اعتمادا على التصميم التجريبي.