القياس المتزامن للكالسيوم داخل الخلايا وإمكانات الغشاء في البطانة الدماغية للفأر

خذ أجزاء من الشريان الدماغي الخلفي للفأر.

احتضان بمحلول إنزيم لتحلل مصفوفة الأنسجة ، وتخفيف الخلايا.

استبدل المحلول بمخزن مؤقت، ثم انقل مقطعا إلى غرفة التسجيل.

بين النسيج الضام وطبقات خلايا العضلات الملساء ، وعزل الأنبوب البطاني الأساسي.

قم بتأمين الأنبوب وإزالة الطبقات المنفصلة وإضافة مخزن مؤقت فسيولوجي.

ضع الغرفة داخل نظام تسجيل مع تدفق عازل مستمر.

أدخل مؤشر الكالسيوم الفلوري الذي يدخل الخلايا البطانية ، ثم أدخل قطب تسجيل في الخلية.

قم بإعطاء دواء يحفز تدفق أيونات الكالسيوم ويحفز إشارات المصب لإطلاق الكالسيوم من الشبكة الإندوبلازمية.

يرتبط المؤشر بالكالسيوم ، وعند الإثارة ، ينبعث منه مضانة.

تؤدي زيادة الكالسيوم إلى تنشيط قنوات البوتاسيوم المعتمدة على الكالسيوم ، مما يتسبب في تدفق البوتاسيوم وتغيير إمكانات الغشاء.

سجل في نفس الوقت التغييرات في الكالسيوم داخل الخلايا عبر إشارة الفلورسنت وإمكانات الغشاء باستخدام القطب.

في هذا الإجراء ، قم بإعداد جهاز التريتوري باستخدام مجهر وكاميرا ومرحلة من الألومنيوم تحمل غرفة ومعالجات دقيقة. قم بتأمين حقنة صغيرة بوحدة تحكم في المضخة المجاورة للمرحلة والعينة. بعد ذلك ، قم بإعادة ملء ماصة التخلي بالكامل بالزيت المعدني ، وقم بتثبيتها فوق مكبس المحقنة الدقيقة.

بعد ذلك ، باستخدام المحقنة الدقيقة مع وحدة التحكم في المضخة ، اسحب حوالي 130 نانولترا من محلول التفكك في الماصة مع ضمان عدم وجود فقاعات هواء. بعد ذلك ، ضع الأجزاء الشريانية السليمة في مليلتر واحد من محلول التفكك مع التركيزات المطلوبة من الإنزيمات في أنبوب زجاجي سعة 10 ملليلتر.

احتضن عند 34 درجة مئوية لمدة 10 إلى 12 دقيقة للهضم الجزئي. بعد الهضم ، استبدل محلول الإنزيم ب 5 ملليلتر من محلول التفكك الطازج. باستخدام ماصة سعة 1 ملليلتر، انقل جزءا واحدا إلى الغرفة التي تحتوي على محلول تفكك في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك، ضع الماصة في محلول التفكك في الحجرة، وضعها بالقرب من أحد طرفي الوعاء المهضوم. اضبط معدلا في حدود 2 إلى 5 نانولتر في الثانية على وحدة التحكم في المضخة لتجربة لطيفة. أثناء المشاهدة من خلال 100 مرة إلى 200 مرة التكبير ، اسحب وإخراج الجزء الشرياني لفصل خلايا العضلات الملساء أثناء إنتاج أنبوب بطاني.

إذا لزم الأمر ، استخدم ملقطا رفيع الرؤوس بعناية لفصل adventitia المنفصل والصفيحة المرنة الداخلية عن الأنبوب البطاني. تأكد من أن جميع خلايا العضلات الملساء متفككة وأن الخلايا البطانية فقط هي التي تبقى كأنبوب سليم.

باستخدام أجهزة المعالجة الدقيقة، قم بتأمين كل طرف من طرفي الأنبوب البطاني على الغطاء الزجاجي لغرفة الانصهار الفائق باستخدام ماصات تثبيت زجاج البورسليكات. اغسل خلايا العضلات الملساء المنفصلة من الغرفة ، واستبدل محلول التفكك باثنين من كلوريد الكالسيوم المليمولار.

انقل المنصة المتنقلة المثبتة في الأنبوب البطاني إلى مجهر الصخ الفائق والحفارة التجريبية. بعد ذلك ، استخدم ستة خزانات نظيفة سعة 50 مليلتر للتوصيل المستمر ل PSS والمحاليل الدوائية ذات الصلة أثناء التجربة.

استخدم صمام التحكم في التدفق المضمن لضبط معدل التدفق يدويا متسقا مثل التدفق الرقائقي مع مطابقة تغذية التدفق مع الشفط الفراغي. توصيل PSS إلى الغرفة لنقل الأنبوب البطاني لمدة خمس دقائق على الأقل قبل تسجيل بيانات الخلفية وتحميل الصبغة.

لقياس إمكانات الغشاء في وقت واحد مع تركيز الكالسيوم داخل الخلايا ، اسحب قطبا كهربائيا حادا وردمه بكلوريد البوتاسيوم المولي للتسجيل من الخلايا المحملة بصبغة Fura-2.

لدراسة الاقتران بين الخلايا عن طريق نقل الصبغة ، قم بإعادة ملء القطب الصغير بنسبة 0.1٪ يوديد بروبيديوم المذاب في اثنين من كلوريد البوتاسيوم المولاري. بعد ذلك ، ضع القطب فوق سلك فضي مغطى بالكلوريد في حامل الماصة المتصل بمرحلة رأس مقياس كهربية مؤمن بمعالج دقيق.

استخدم المعالج الدقيق لوضع طرف القطب الكهربائي لفترة وجيزة في PSS المتدفق في الغرفة أثناء المشاهدة من خلال الهدف أربع مرات. بعد ذلك ، اضبط إمكانات غشاء الراحة على الصفر بما يتفق مع إمكانات الحمام المؤرض.

إذا رغبت في ذلك ، استخدم شاشات خط الأساس المسموعة المرتبطة بأجهزة القياس الكهربائي لربط درجة الصوت بالتسجيلات المحتملة. بعد ذلك ، قم بزيادة التكبير إلى 400 مرة باستخدام هدف 40 مرة ، ووضع طرف القطب فوق خلية من الأنبوب البطاني مباشرة.

اضبط النافذة الضوئية باستخدام برنامج القياس الضوئي للتركيز على حوالي 50 إلى 80 خلية بطانية. بعد ذلك ، ضع القطب برفق في إحدى خلايا الأنبوب البطاني باستخدام المعالج الدقيق ، وانتظر دقيقتين على الأقل حتى تستقر إمكانات غشاء الراحة.

بمجرد أن تصبح إمكانات الغشاء المريح مستقرة عند قيمتها المتوقعة ، قم بتشغيل أنبوب المضاعف الضوئي على واجهة التألق في حالة عدم وجود ضوء وابدأ في الحصول على تركيز الكالسيوم داخل الخلايا عن طريق إثارة Fura-2 ، بالتناوب ، عند 340 و 380 نانومتر أثناء جمع انبعاث التألق عند 510 نانومتر.

بمجرد تحديد القياسات المتزامنة لإمكانات الغشاء وتركيز الكالسيوم داخل الخلايا ، اترك حوالي خمس دقائق للاندماج الفائق للأنبوب البطاني مع PSS بمعدل تدفق رقائقي ثابت قبل استخدام الأدوية.

ضع الدواء المحضر في PSS على غرفة التروجين بمعدل تدفق ثابت. أثناء العلاج بالعقاقير ، قم بقياس إمكانات الغشاء بنسبة F340 / F380 في وقت واحد. بمجرد الانتهاء من التجربة ، اسحب القطب من الخلية. بعد ذلك ، أوقف التسجيلات الخاصة بإمكانات الغشاء وتركيز الكالسيوم داخل الخلايا واحفظ الملفات لتحليل البيانات.