الكشف عن الاستجابات الفسيولوجية من الخلايا العصبية الحسية في ذبابة الفاكهة

قم بإرفاق ذبابة الفاكهة السوداء المخدرة المعدلة وراثيا على جانبها بغطاء.

مد ساقيه الأمامية وتثبيتها لفضح الأجزاء الرصغية.

تحتوي هذه الأجزاء على خلايا عصبية تذوقية تعبر عن مجمعات مؤشر الكالسيوم التي تتألق في شكل مرتبط بالكالسيوم.

ارسم حاجزا مسعورا حول الذبابة للاحتفاظ بالمحلول.

اسمح للذبابة بالتعافي وتراكب محلول ملحي مخزن على الأجزاء الرصغية المكشوفة لترطيبها.

تحت المجهر متحد البؤر ، راقب الأجزاء الرصغية وصور الخلايا العصبية الذوقية على أعماق مختلفة للحصول على مضان ما قبل التحفيز.

أضف محلول تحفيز يحتوي على روابط محبة للدهون على المقطع.

ترتبط هذه الروابط بمستقبلات الخلايا العصبية الذوقية ، مما يؤدي إلى بدء مسارات الإشارات وتحفيز فتح قنوات الكالسيوم.

هذا يسمح لأيونات الكالسيوم من السائل خارج الخلية بدخول السيتوبلازم والارتباط بمجمعات مؤشر الكالسيوم ، مما يؤدي إلى انبعاث التألق.

عند ملاحظتها مرة أخرى ، تؤكد الزيادة في التألق العصبي الاستجابة الفسيولوجية العصبية للترابط.

بعد تخدير الذبابة ، قم بتثبيتها على غطاء 0.17 ملم ، باستخدام قطرة صغيرة جدا من طلاء الأظافر الشفاف. اربط جانب الذبابة بالشريحة باستخدام القطرة بأكملها. بعد ذلك ، تحت مجهر تشريح ، استخدم فرشاة رسم مبللة لتمديد الساق الأمامية للذبابة. بعد ذلك ، باستخدام شريطين رفيعين جدا من الشريط ، قم بتأمين الجزأين الرصغيين الأول والخامس في الغطاء.

إذا كان سيتم تصوير الخلايا العصبية في خرطوم ، فضع شريطا رفيعا آخر من الشريط اللاصق فوق منصة خرطوم لفضح الملصق. الآن ، قم بعمل جدار قصير حول الذبابة باستخدام قلم PAP. دع التخدير يزول لمدة نصف ساعة قبل أخذ القياسات. بالنسبة لهذا البروتوكول ، قم بإعداد التخفيفات اللازمة لمحلول ربط المخزون 1 ملليغرام لكل مليلتر باستخدام PBST.

لبدء الإجراء ، قم بتراكب 10 ميكرولتر من PBST على الأجزاء الرصغية الآمنة والمكشوفة. هذا يرطب الساق ويمنعها من الانجراف عن التركيز. بعد ذلك ، ركز على الأجزاء باستخدام نظام بصري يمكنه تحقيق إشارة مضان جيدة بدقة زمنية سريعة ، مثل مجهر ثنائي البؤر القرص الدوار مع كاميرا sCMOS. اجمع ثلاث مكدسات Z قبل التحفيز من الخلايا العصبية ذات الأهمية في الجزء الرصغي.

في هذا المثال، يتم التقاط الصور بتعريض ضوئي يبلغ 200 مللي ثانية وتجميع 2 × 2 على قسم 6 ميكرون × 1/2 ميكرون كل ثانيتين. تأكد من تحسين قوة الليزر لتقليل التبييض الضوئي ، مع السماح بنسبة إشارة إلى ضوضاء عالية. هنا ، يتم تشغيل ليزر 491 نانومتر و 100 مللي واط عند ناقل حركة بنسبة 30٪.

يجب أن تكون الإشارة قابلة للاكتشاف قبل التحفيز ، ولكن لا تقترب من التشبع. الآن ، قم بوضع 10 ميكرولتر من محلول التحفيز على الجزء الرصغي ذي الأهمية. أثناء سحب العينات، كن حذرا جدا لتجنب لمس الساق أو أي من جسم الذبابة، وإلا سيتحرك الطرسي من موضعه. بعد ذلك ، احصل على الفور على الصور الأولى بعد التحفيز ، واستمر في جمع صور كافية لتوثيق الحد الأقصى للتغيير في التألق.