JoVE Encyclopedia of Experiments
علم الأعصاب
0 مشاهدات • 3:54 د • July 8th, 2025
ضع غطاء يحتوي على خلايا الكلى الجنينية التي تعبر عن القنوات الأيونية المعتمدة على الضوء وبروتين مراسل الفلورسنت على غرفة قياس مطبقة بالسيليكون. أغلقه وأضف مخزن مؤقت خارجي.
ضع هذه الغرفة تحت المجهر. ضع قطب حمام مملوء بالأجار. Perfuse مع مخزن مؤقت لإزالة الوسائط المتبقية والخلايا الميتة.
باستخدام مرشح مضان ، حدد الخلية المستهدفة وركز عليها.
قم بتوصيل ماصة رقعة بمعالج دقيق. اضغط لمنع الانسداد والاقتراب من الخلية.
ضع الماصة بالقرب من الخلية وحرر ضغطا موجبا لتشكيل رقعة غشائية عند الحافة.
بعد تشكيل رقعة الغشاء ، قم بالضغط السلبي لتمزيق الغشاء.
ضع ضوءا بطول موجي معين لفتح القنوات الأيونية. يتم تسجيل حركة الأيونات كتغيير في الجهد بواسطة القطب.
للبدء ، أغلق غرفة القياس بالسيليكون لمنع تسرب المخزن المؤقت الخارجي. ثم ضع غطاء واحد في الغرفة وأغلقه. املأ الغرفة بعناية بمخزن مؤقت خارج الخلية لمنع الخلايا من الانفصال. بعد ذلك ، ضع غرفة القياس تحت المجهر باستخدام هدف 40x لتصور الخلية.
بعد ذلك ، ضع جسر أجار فوق قطب الحمام وضعه في الغرفة مع مستشعر مستوى السائل ومخرج التروية لمعالج الحمام. استبدل المحلول خارج الخلية مرتين ب 1 ملليلتر من المحلول الخارجي الطازج لإزالة وسط الثقافة المتبقي والخلايا المنفصلة. اجعل الخلايا في بؤرة التركيز وابحث عن خلية منقولة ، والتي تحتاج إلى عزلها عن الخلايا الأخرى. بعد ذلك ، استخدم مجموعة مرشحات ثلاثية النطاق وضوء برتقالي لإثارة mCherry وتصوره.
قم بتركيب الماصة على حامل الماصة، وقم بالضغط الإيجابي لمنع انسداد الأطراف. حدد موقع طرف الماصة اللاصقة أسفل المجهر وانتقل بالقرب من الخلية باستخدام المعالج الدقيق.
ضمن برنامج الحصول على البيانات ، ابدأ اختبار الغشاء في وضع Bath وقم بتطبيق خطوة الجهد. تحقق مما إذا كانت مقاومة الماصة في النطاق المطلوب من 1.3 إلى 3.0 ميغا أوم. بعد ذلك، قم بتصفير تيارات الإزاحة واضبط إمكانات الماصة عن طريق تدوير مقبض إزاحة الماصة على مكبر الصوت.
لإنشاء رقعة في تكوين الخلية بأكملها، اقترب ببطء من الخلية باستخدام ماصة التصحيح من الأعلى وحرر الضغط الإيجابي قبل لمس الخلية مباشرة. قم بتعويض سعة الماصة عن طريق تدوير مقبض تعويض سعة الماصة للحصول على استجابة مسطحة لنبضة الاختبار.
قم بتبديل اختبار الغشاء إلى وضع الخلية. بعد ذلك ، قم بتمزيق الرقعة دون تدمير الختم عن طريق تطبيق نبضات قصيرة من الضغط السلبي أو الضغط السلبي مع زيادة القوة للحصول على تشكل الخلية بأكملها.
ابدأ تعويض مقاومة السلسلة عن طريق تعيين معلمتي الخلية الكاملة ، سعة الخلية ومقاومة السلسلة. سجل التيارات التي يسببها الضوء عند إمكانات احتجاز مختلفة. يوضح هذا الشكل أنه أثناء الإضاءة بالضوء الأخضر ، يتميز PSACR1 بتيار عابر سريع يتحلل بسرعة إلى مستوى تيار ثابت.