التلوين المناعي الفلوري للخلايا العصبية في الحصين داخل رقاقة ميكروفلويديك

خذ شريحة ميكروفلويديك تحتوي على الخلايا العصبية الحصين للفئران.

تتميز الشريحة بخزانات جسدية ومحورية ، مع مقصورات مقسمة بواسطة أخاديد صغيرة ، مما يؤدي إلى تقسيم الخلايا العصبية بشكل فعال وعزل المناطق الجسدية والمحورية.

قم بإزالة الوسائط وإضافة الفورمالديهايد. احتضان لإصلاح الخلايا العصبية والحفاظ على بنيتها.

قم بإزالة الفورمالديهايد الزائد واغسله بمحلول عازل. ثم أضف منظفا لاختراق الخلايا العصبية.

استبدل المنظف بمحلول مانع لمنع مواقع الربط غير المحددة.

قم بإزالة محلول المنع واحتضانه بالأجسام المضادة الأولية التي ترتبط بعلامات عصبية مشبكية محددة ، وهي بروتينات غشائية متكاملة على الحويصلات المتشابكة.

قم بإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة واغسلها بمحلول عازل.

احتضان الأجسام المضادة الثانوية الموسومة بالفلوروفور والتي ترتبط بالأجسام المضادة الأولية التي تستهدف العلامات المتشابكة.

قم بإزالة الأجسام المضادة الثانوية غير المرتبطة وغسلها بمحلول عازل.

تحت المجهر متحد البؤر ، قم بتصوير الشريحة لتصور العلامات المشبكية العصبية الفلورية.

لبدء التلوين المناعي الفلوري ، قم بإزالة معظم الوسائط من الشريحة ، مع الحفاظ على رطوبة المقصورات الداخلية. على الفور ، أضف 100 ميكرولتر من محلول التثبيت إلى الآبار العلوية للمقصورات المحورية والجسدية.

بعد دقيقة واحدة ، أضف 100 ميكرولتر من محلول التثبيت إلى الآبار السفلية ، وقم بإصلاح الخلايا لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة معظم المحلول من الآبار ، وأضف على الفور 150 ميكرولترا من PBS إلى كل من الآبار العلوية للمقصورات المحورية والجسدية. انتظر دقيقتين حتى يتدفق PBS إلى الآبار السفلية ، ثم قم بإزالة PBS وشطف الآبار مرتين أخريين باستخدام نفس العملية.

بعد الشطف الأخير ، قم بإزالة معظم PBS من آبار الرقاقة ، وأضف على الفور 150 ميكرولترا من PBS مع 0.25٪ Triton X-100 إلى كل من الآبار العلوية للمقصورات المحورية والجسدية.

انتظر لمدة 15 دقيقة ، ثم قم بإزالة معظم السائل من الآبار. أضف على الفور 150 ميكرولترا من محلول الحجب إلى كل من الآبار العلوية للمقصورات المحورية والجسدية. بعد 15 دقيقة ، قم بإزالة معظم السائل من الآبار ، وأضف على الفور 100 ميكرولتر من محلول الجسم المضاد الأساسي إلى كل من الآبار العلوية للمقصورات المحورية والجسدية.

قم بتغطية الرقاقة لتقليل التبخر ، واحتضان الخلايا في الجسم المضاد الأساسي لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، اشطف الرقاقة عن طريق إزالة معظم المحلول ، وإضافة 150 ميكرولترا من PBS على الفور إلى كل من الآبار العلوية للمقصورات المحورية والجسدية. بعد خمس دقائق ، قم بإزالة PBS من كلا البئرين ، وكرر الشطف مرتين أخريين.

الآن ، قم بإزالة معظم السائل من الآبار ، وأضف على الفور 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية في PBS إلى كل من الآبار العلوية للمقصورات المحورية والجسدية. قم بتغطية الرقاقة لتقليل التبخر ، واحتضان الرقاقة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. كما هو موضح سابقا ، اشطف الرقاقة ثلاث مرات باستخدام PBS. بعد ذلك ، قم بتركيب الرقائق وتصويرها كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب.