توليد العضيات العصبية الدوبامينية من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

خذ الخلايا الجذعية الجنينية البشرية ، أو hESCs ، في قارورة مغلفة بمصفوفة خارج الخلية.

استبدل الوسط بوسط تحريض عصبي واحتضان الخلايا الجذعية الكينية العصبية وتمييزها إلى خلية سلفية عصبية ، أو مستعمرات NPC.

أضف محلول إنزيمي لفصل المستعمرات.

جهاز الطرد المركزي ، وإزالة المادة الطافية ، وإعادة تعليق الخلايا في وسط الحث مع عوامل النمو لدعم تمايز NPC.

أضف تعليق الخلية إلى آبار صغيرة معكوسة على شكل هرمي لتشكيل مجالات عصبية ثلاثية الأبعاد.

انقل المجالات العصبية إلى صفيحة مغلفة بمصفوفة خارج الخلية تحتوي على وسط تمايز مع عوامل النمو والجزيئات الصغيرة. احتضان تحت التحريض لتعزيز التمايز إلى الخلايا العصبية السلفية الدوبامينية.

استبدل الوسط بوسط النضج العصبي وضع المجالات العصبية على قرص غشائي في ملحق بئر ثقافة ، مما يسمح بانتشار الهواء والمواد المغذية.

احتضان في ظل ظروف ثابتة لتشكيل عضيات ثلاثية الأبعاد تتكون من خلايا عصبية دوبامين ناضجة.

هذه العضيات ، التي تحاكي الدماغ النامي ، مفيدة لدراسة تنكس الخلايا العصبية الدوبامين ، وهي سمة من سمات مرض باركنسون.

استبدل وسط الخلايا الجذعية المستخدم للحفاظ على ميزات تعدد القدرات في hESCs ، بوسط خال من المصل يحتوي على كوكتيل تثبيط SMAD مزدوج لبدء الحث العصبي ، و 10 مثبطات ميكرومولار ROCK لزيادة معدل بقاء الخلايا أثناء المرور في اليوم التالي. في اليوم الأول ، قم بإعداد لوحة microwell ب 2.5 مل لكل بئر من الوسط الخالي من المصل الذي يحتوي على نفس تركيز مثبط ROCK وجزيئات تثبيط SMAD المزدوجة.

للتمييز بين الخلايا نحو النمط البطني للأنبوب العصبي ، أضف SHH و FGF8 بمعدل 100 نانوغرام لكل مليلتر وناهضين منعمين بالميكرومولار. بعد إضافة الوسط ، قم بالطرد المركزي للوحة عند 1,200 مرة جم لمدة خمس دقائق لإزالة فقاعات الهواء من الآبار الصغيرة. بمجرد أن تصبح لوحة microwell جاهزة للاستخدام مع نصف وسط ممايز ، قم بإزالة وسط hESCs ، واغسلها بسرعة باستخدام PBS الخالي من الكالسيوم وكلوريد المغنيسيوم.

قم بفصل المستعمرات إلى معلق أحادي الخلية عن طريق إضافة 7.5 مل من المحلول الأنزيمي المؤتلف إلى قارورة T75. احتضان الخلايا لمدة دقيقتين عند 37 درجة مئوية ، ثم أضف 7.5 من DMEM F-12. بعد ذلك ، اجمع تعليق الخلية ، وجهاز الطرد المركزي عند 300 مرة جم لمدة خمس دقائق. ثم قم بإزالة المادة الطافية ، واحسب الخلايا في نفس الوسط المستخدم لتحضير لوحة الميكروويل.

اضبط الحجم المتوسط للحصول على تعليق الخلية ، مما يسمح بتكوين مجالات عصبية تحتوي على 1,000 خلية لكل ميكروبئر ، عن طريق تحضير 4.7 مليون خلية في 2.5 مل من الوسط ، وإضافتها إلى 2.5 مل من الوسط السابق الموضوعة بالفعل في اللوحة. من أجل توزيع الخلايا بشكل صحيح في كل ميكروبئر ، قم بهز اللوحة برفق ، وقم بطردها بمعدل 300 مرة جم لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، احتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة لتوليد الكرات.

في اليوم الثاني ، اغسل الآبار الصغيرة برفق بوسط ، وانقل الكرات في ستة ألواح جيدة المعالجة بالأنسجة ضع الكرات في دوران عند 37 درجة مئوية ، وقم بتغيير نصف الوسط بوسط طازج كل يومين إلى ثلاثة أيام. في اليوم 3 إلى 13 ، لتعزيز الحث العصبي والتحويل إلى أسلاف عصبية ذات هوية الدماغ المتوسط ، استكمل الوسط بثلاثة مثبطات ميكرومولار GSK-3-beta. قسم العينة إلى ستة صفيحتين جديدتين معالجة جيدا للأنسجة لتقليل كثافة الكرة وتجنب تراكم الكرة.

في اليوم الثامن ، ابدأ النضج العصبي عن طريق التبديل إلى وسط جديد مع عوامل النمو ، وقم بتغيير الوسط كل يومين إلى ثلاثة أيام. في اليوم 21 ، ضع إدراج لوحة ثقافة واحدة في بئر واحد من صفيحة جديدة مكونة من ستة آبار ، وأضف 1.2 مل من وسط النضج العصبي المستخدم لتمايز الغلاف العصبي أسفل ملحق الغشاء. ثم قم بإزاحة غشاء PTFE على إدراج لوحة الثقافة.

أخيرا ، لتوليد العضوية العصبية ، قم بزرع حوالي 100 مجال عصبي في ظل ظروف واجهة الهواء والسائل على غشاء PTFE. أوقف الدوران من هذه الخطوة وقم بتغيير الوسيط كل يومين إلى ثلاثة أيام حتى يتم تحقيق النقطة الزمنية المطلوبة للتمييز.