التنميط الجهد بوابات مرنا قناة البوتاسيوم التعبير في الخلايا العصبية Nigral باستخدام خلية واحدة RT - PCR تقنيات

الهدف العام من هذا الإجراء هو اكتشاف الحمض النووي الريبي المرسال في الخلايا العصبية الفردية. يتم تحقيق ذلك عن طريق تثبيت التصحيح وتسجيل الخلايا العصبية الفردية ثم شفط السيتوبلازم بالكامل من كل خلية عصبية مسجلة من Mr.mRNA والسيتوبلازم. يتم تصنيع CD NA وتضخيمه بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

في النهاية ، يمكن اكتشاف mRNAs محددة للقنوات الأيونية للمستقبلات والإنزيمات من خلال نظام تصوير هلام تقليدي. اسمي ، أعمل في مركز العلوم الصحية بجامعة تينيسي. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن كمية التصوير بالرنين المغناطيسي في عصب واحد صغيرة للغاية ويمكن فقدانها بسهولة.

ابدأ هذا البروتوكول باستخدام هزاز لقطع شرائح الدماغ الإكليلية بسمك 300 ميكرومتر والتي تحتوي على الجزء المنقاري الأوسط من الأسود الجوهري. يمكن عزل الأدمغة من فئران سبرا دوللي التي يبلغ عمرها 15 إلى 40 يوما. يتم إجراء عملية قطع الشرائح في محلول قطع عالي السكروز ، مؤكسج بنسبة 95٪ أكسجين و 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، وعند درجة حموضة 7.4 ، احتضان الشرائح في السائل الشوكي الدماغي الاصطناعي وفقاعات ب 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، 95٪ غاز أكسجين.

حافظ على درجة الحرارة عند 34 درجة مئوية واترك الشرائح هناك لمدة 45 دقيقة. ثم احتفظ بشرائح الدماغ في درجة حرارة الغرفة حتى التسجيل. ابدأ بنقل شريحة دماغ واحدة إلى غرفة تسجيل مشبك التصحيح.

يتغذى باستمرار مع السائل النخاعي الدماغي الاصطناعي المؤكسج عند 32 درجة مئوية. املأ ماصات الأوتوكلاف بمحلول الأوتوكلاف داخل الخلايا المحضر بالماء الخالي من الحمض النووي والحمض النووي الريبي. اخفض الماصة المحملة في الحمام.

تأكد من أن المقاومة تتراوح بين اثنين وثلاثة ميجا أوم. أولا ، حدد موقع الأسود الجوهري من خلال موقعه المميز والتشريحي. ثم باستخدام بصريات namar وهدف 60 × ، حدد خلايا كبيرة في SNC و SNR للتسجيل.

هذه هي الخلايا العصبية الدوبامين أو GABAergic الممكنة دون تردد. استخدم تكوين الخلية الكاملة التقليدي لختم محكم الجيجا لعمل المشبك الحالي ومشبك الجهد. يجب إجراء هذه التسجيلات بشكل عام في أقل من خمس دقائق لتقليل تدهور الرنا المرسال.

في حوالي دقيقة ، من الممكن توفير بصمات الأصابع الفيزيولوجية الكهربية للخلايا العصبية ذات الأهمية عن طريق تسجيل خصائصها الغشائية والارتفاعية فقط. بعد الحصول على بيانات من خلية عصبية ذات أهمية ، استخدم شفطا لطيفا للفم لشفط السيتوبلازم. لا ينبغي كسر الختم المحكم بخلاف ذلك.

قد يتم امتصاص الحطام خارج الخلية ، بما في ذلك mRNA ، في ماصة التصحيح وتلويث محتوى الخلية. طرد محتوى الخلية في أنبوب PCR سعة 0.2 ملليلتر عن طريق كسر طرف الماصة وتطبيق ضغط إيجابي خفيف. عند الانتهاء ، ضع الأنبوب على الفور في مجمد سالب 20 لاستبعاد تلوث الحطام خارج الخلية الذي قد يحتوي على mRNAs.

قم بإجراء تحكم سلبي عن طريق جمع محتويات ماصة التصحيح التي تم إنزالها في الأنسجة دون استخدام أي شفط. بعد جمع محتوى الخلية من ما بين 10 إلى 20 خلية عصبية تبدأ على الفور في تفاعل النسخ العكسي. لتقليل تدهور mRNAs ، ابدأ بهضم أي DNA جيني ملوث بالحمض النووي ، واحد لمدة خمس دقائق ، 25 درجة مئوية.

هذه الخطوة حاسمة في الحد من الإيجابيات الكاذبة المحتملة ولا ينبغي التحايل عليها. ثم قم بتعطيل الحمض النووي الذي يحتوي على 1.2 ميكرولتر من 25 ملليمولار EDTA واحتضان العينات عند 70 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. الآن ، استخدم مجموعة متوفرة تجاريا لتصنيع CD NA للتحقق من إزالة الحمض النووي الجيني بالكامل.

قم بتشغيل تفاعل تحكم لكل عينة بدون نسخ عكسي. بينما تظل جميع مكونات التفاعل الأخرى كما هي. قم بتخزين المنتجات على حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر حتى تصبح هناك حاجة إليها لتصميم PCR.

البادئات وفقا للتسلسلات في بنك الجنرال ، كلما أمكن ذلك ، بعمل مقدمة T تمتد على الإصلاحات الأولية للمساعدة في اكتشاف تلوث الحمض النووي الجيني. للتحقق من فعالية أزواج التمهيدي ، اختبرها على قرص مضغوط NA للدماغ بالكامل للمرحلة الأولى. يقوم تفاعل البوليميراز المتسلسل بتضخيم خمسة ميكرولترات من 30 ميكرولتر من CDNAs لمدة 35 دورة باستخدام بروتوكول الدورة الحرارية القياسي.

بالنسبة للمرحلة الثانية ، يقوم تفاعل البوليميراز المتسلسل بتضخيم ميكرولتر واحد من منتج PCR في المرحلة الأولى بنفس الإصلاح الأساسي واستخدام ملف تعريف ركوب الدراجات المعدل قليلا. الآن افصل المنتجات على جل 2.5٪ AGROS وتصورها باستخدام بروميد AUM أو جل أخضر. تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية ، قم باستئصال نطاقات الحمض النووي الموجبة وتسلسلها باستخدام مجموعة متوفرة تجاريا لجمع الحمض النووي.

تمت مقارنة الخصائص الفيزيولوجية الكهربية للخلايا العصبية في nigra الكبيرة و pars و compacta و pars reticulata. أظهرت الخلايا العصبية SNR GABAergic ترددا أعلى ، ارتفاعا تلقائيا عند حوالي 10 هرتز. كان للمسامير مدة أساسية حوالي مللي ثانية واحدة عند حقن التيار المفرط الاستقطاب.

أظهرت الخلايا العصبية SNR GABAergic استجابة SAG خفية تشير إلى تيار منشط أسبوعيا. في المقابل ، أظهرت الخلايا العصبية الدوبامين الأسود طفرات تلقائية منخفضة التردد مع مدة أساسية تبلغ حوالي ثلاثة أجزاء من الثانية. أظهرت الخلايا العصبية الدوبامينية أيضا SAG واضحا استجابة لفرط الاستقطاب مما يشير إلى تعبير قوي عن تيار IH في الخلايا العصبية SNR GABAergic ، ولكن ليس في الخلايا العصبية الدوبامينية.

اكتشفت الخلية المفردة R-T-P-C-R MRNA لحمض الجلوتاميك ديكاربوكسيلاز واحد ، وهو إنزيم رئيسي في تخليق GABA. في المقابل ، تم تحديد الخلايا العصبية الدوبامينية SNC و SNR ، ولكن ليس في الخلايا العصبية GABAergic. اكتشفت خلية واحدة R-T-P-C-R MRNA للتيروزين هيدروكسيلاز ، وهو إنزيم رئيسي لتخليق الدوبامين.

تم استخدام الخلية المفردة التالية R-T-P-C-R لتشكيل تعريف التعبير عن الوحدات الفرعية ثلاثية القنوات KV المنشطة بالجهد ، والتي تختلف خصائص قنوات البوتاسيوم ذات الجهد المسور. في مثال SNR gaba ، تم اكتشاف الخلايا العصبية mRNAs ل KV 3.1 و 3.2 و 3.3 و 3.4 في مثال الخلايا العصبية S-N-R-D-A فقط. تم الكشف عن KV 3.2 و 3.3 و 3.4 في البيانات المجمعة.

تم اكتشاف KV 3.1 بشكل متكرر في الخلايا العصبية SNR GABAergic أكثر من الخلايا العصبية الدوبامين nigro مما يشير إلى مستوى تعبير أعلى من KV 3.1 في الخلايا العصبية السريعة Viking SNR GABA. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر ارتداء القفازات والحفاظ على الأدوات خالية من العلم بعد تطويرها. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأعصاب لاستكشاف تعبير ووظيفة المستقبلات والقنوات الأيونية في الجهاز العصبي.