فصل واحدة الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي ، والحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل ، والحمض النووي الريبي من جالية الفيروسية البيئة باستخدام الكروماتوغرافيا هيدروكسيباتيت

يوضح هذا الفيديو إجراء لفصل التجمعات الفيروسية المختلطة بناء على تركيبة الحمض النووي. يتيح ذلك دراسة التنوع التصنيفي والإمكانيات الوظيفية للتجمعات الفيروسية المعقدة. هنا يتم استخدام هيدروكسيباتيت ، وهو شكل بلوري من فوسفات الكالسيوم في فصل الأحماض النووية.

أولا ، يتم تعبئة عمود هيدروكسيباتيت ثم يتم تطبيق الأحماض النووية الفيروسية المنقاة المتوازنة على العمود ، وتفاعل الشحنة بين أيونات الكالسيوم موجبة الشحنة للهيدروكسيباتيت والعمود الفقري للفوسفات سالب الشحنة للأنواع الفرعية للحمض النووي يربط الأحماض النووية بالعمود. بعد ذلك ، يتم التلميح إلى الحمض النووي الفردي الذي تقطعت به السبل ، D-N-A-R-A والحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل بالتتابع بتركيزات مختلفة من المخزن المؤقت للفوسفات. ثم يتم تحلية الأحماض النووية الناتجة وتركيزها استعدادا للتصور والقياس الكمي والتعرف عن طريق تسلسل الحمض النووي يؤكد الرحلان الكهربائي للهلام agros أنه يمكن فصل أنواع الحمض النووي بأقل من 9٪.

وبالتالي ، تتيح هذه الطريقة تقييم التنوع والقدرة الوظيفية للمجتمعات الفيروسية. مرحبا ، اسمي دوغ فرو ، وأنا باحث مشارك في مختبر الدكتور شانون ويليامسون في معهد جي كريج فينتشر. سأعرض لكم اليوم إجراء لفصل الحمض النووي وحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل والحمض النووي الريبي من مجموعة فيروسات بيئية.

هذه الطريقة لها مزايا على الطرق الحالية مثل العلاج بالنواة ، والتي تستهدف إما الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي. كروماتوغرافيا هيدروكسيباتيت لديها القدرة على التقاط المجتمع الفيروسي بأكمله. تسمح لنا هذه الطريقة بالإجابة على عدة أسئلة في مجال البيئة الفيروسية.

على سبيل المثال ، ما هو إجمالي المكون الجيني أو تنوع المجتمع الفيروسي؟ فكرنا في هذه الطريقة لأول مرة عندما أردنا دراسة تجمعات عوالق ريو بأكملها من خليج تشيسابيك دون التضحية بمجموعة فرعية من التوقيع الجيني. يجب تحضير الحلول اللازمة لهذه التجربة في وقت مبكر وفقا للتعليمات الواردة في البروتوكول المكتوب المصاحب ، وتشمل 0.12 مخزن فوسفات مولي ، ومحلول فوسفات 0.20 مولار ، ومحلول فوسفات مولار 0.40 ، ومحلول فوسفات مولاري.

كل ذلك عند درجة الحموضة 6.8 وهيدروكسيباتيت الماء في يوم التجربة ، قم بموازنة جميع مخازن الفوسفات وهيدروكسيباتيت الماء عن طريق وضعها في حمام مائي 60 درجة مئوية. ابدأ هذا الإجراء بإعداد عمود الاقتصاد الذي سيتم استخدامه لفصل الأحماض النووية الفيروسية. قم بتوصيل محبس بنهاية عمود الاقتصاد وتأكد من إغلاقه.

باستخدام ماصة ، أضف الماء منزوع الأيونات إلى العمود ، ثم ضع الغطاء أعلى العمود واقلب العمود بشكل متكرر لشطفه. اسكب الماء وكرر هذا الغسيل عدة مرات. بعد ذلك ، قم بإزالة قضيب التوقف من عمود econ وقم بتعقيمه لتعقيمه.

قضيب التوقف ليس الأوتوكلاف لأنه سوف يذوب. اشطف قضيب التوقف بالماء المتأين ، ثم مرة أخرى بنسبة 70٪ من الإيثانول واتركه يجف في الهواء بعد التعقيم. استبدل قضيب الإيقاف وأغلقه.

بعد ذلك ، من خلال العمل في غطاء الدخان ، أضف ملليلترا واحدا من طبقة سيجما إلى العمود وقم بتغطية زجاج العمود عن طريق قلب العمود بحركة متدحرجة كما هو موضح هنا. سيقلل الطلاء بطبقة سيجما من التصاق الأحماض النووية بالسطح الزجاجي. أثناء الفصل ، تم طلاء أسطح زجاجية ملحية واحدة.

افتح الديك التوقف وصب في أنبوب مخروطي الشكل. بعد ذلك ، لتوصيل العمود بحمام مائي دائري ، استخدم مشابك لربط العمود بحامل حلقي. قم بتوصيل أنابيب السيليكون من الحمام المائي المتداول ، بحيث يكون تدفق المياه من الحمام المائي من الأسفل إلى الأعلى.

اضبط درجة الحرارة على 60 درجة مئوية وابدأ الدورة الدموية. أثناء الممارسة العملية ، سيتم لف العمود والأنبوب بعامل عازل ، مثل رقائق الألومنيوم أو عزل الأنابيب الرغوية. لتقليل فقد الحرارة ، لا تظهر هذه الخطوة هنا.

من أجل تصور الإجراء بشكل أفضل ، أغلق قضيب التوقف. باستخدام ماصة ، أضف 10 مل من الماء الخالي من الحمض النووي الريبي المعقم. افتح قضيب التوقف واترك الماء يجف.

ثم اغسلها مرة أخرى بعد الغسيل الثاني. اشطف مرتين ب 10 مل من الحمض النووي الريبي المعقم الخالي من 0.12 مولار فوسفات المخزن المؤقت والصب بين الغسل. العمود جاهز الآن لكروماتوغرافيا هيدروكسيباتيت.

تأكد من إغلاق قضيب إيقاف عمود econ. ثم باستخدام ماصة مصلية معقمة سعة ملليلترين ، أضف ببطء ملليلترين من شهية الهيدروكسي المعاد ترطيبها المعلقة المحضرة إلى أسفل العمود. استبدل غطاء العمود.

اسمح لشهية الهيدروكسي بالاستقرار تحت قوة الجاذبية لمدة 30 دقيقة. تتطلب هذه الطريقة الاهتمام بالتفاصيل. يعالج عمود شهية الهيدروكسي بمعدل 0.25 إلى 0.5 مل في الدقيقة.

لذلك من المهم جدا مراقبة العمود عن كثب حتى لا يجف. بعد مرور 30 دقيقة ، افتح قضيب التوقف لتصريف المخزن المؤقت في حاوية نفايات. أغلق قضيب التوقف وتخلص من التدفق من خلال.

امزج الأحماض النووية مع 0.12 مولار فوسفات في حجم نهائي قدره 500 ميكرولتر واحتضانه 60 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. سيؤدي ذلك إلى موازنة الأحماض النووية مع درجة حرارة العمود وسيعزز فصل أنواع الحمض النووي المختلفة عن طريق إزالة أي هياكل ثانوية قد تكون موجودة. باستخدام ماصة مصلية سعة ملليلتر، ضع محلول الحمض النووي بسرعة على شهية الهيدروكسيل، مع التأكد من عدم إزعاج العمود.

بمجرد تدفق 500 ميكرولتر بالكامل إلى العمود ، يمكن إضافة كمية صغيرة من 0.12 مولي من الفوسفات إلى الجزء العلوي من العمود لمنعه من الجفاف. اسمح للأحماض النووية بالارتباط بشهية الهيدروكسي لمدة 30 دقيقة. بعد حضانة الربط ، ضع أنبوبا مخروطيا سعة 15 ملليلتر أسفل العمود.

ثم افتح قضيب التوقف واجمع عينة أولية تبلغ 500 ميكرولتر ، والتي تحتوي على حمض نووي واحد تقطعت به السبل. بمجرد جمع 500 ميكرولتر ، أغلق قضيب التوقف. بعد ذلك ، أضف ستة ملليلتر من 0.12 مولار فوسفات إلى شهية الهيدروكسي ، مع التأكد من عدم إزعاج العمود.

ثم افتح الديك التوقف واستمر في جمع التدفق من خلال احتواء الحمض النووي الذي تقطعت به السبل في نفس أنبوب 15 مليلتر من الخطوة السابقة. بعد جمع ما يقرب من ستة ملليلتر ، أغلق محبس. أضف حجما واحدا من محلول كحول إيزوأميل الفينول كلوروفورم إلى الأنبوب الممزوج بقوة عن طريق الدوامة ، ثم جهاز الطرد المركزي عند 3 ، 500 مرة جم لمدة 15 دقيقة.

بعد الطرد المركزي ، سيحتوي الأنبوب على طبقتين. انقل طبقة الموافقة العلوية ، التي تحتوي على خيط واحد من الحمض النووي إلى أنبوب جديد سعة 15 مليلتر ، وقم بتخزين العينة في درجة حرارة الغرفة لتصفية وتنقية الحمض النووي الريبي من العمود ، أضف ستة ملليلتر من محلول فوسفات 0.20 مولار واجمع التدفق قبل استخدام أنبوب جديد سعة 15 ملليلترا. ثم قم بإجراء استخراج الفينول كلوروفورم.

بالنسبة لعينة الحمض النووي المفردة التي تقطعت بها السبل ، كرر هذه العملية باستخدام ستة ملليلتر من 0.40 مولار فوسفات عازلة لتصفية وتنقية الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل من العمود. أخيرا ، لتجريد العمود من أي حمض نووي مزدوج متبقي تقطعت به السبل. كرر هذه العملية مرة أخرى.

هذه المرة باستخدام ستة ملليلتر من 1.00 مولار فوسفات عازلة لتحلية عينات الحمض النووي. انقل أربعة إلى خمسة ملليلتر من كل عينة إلى جهاز مرشح الطرد المركزي Ultra Four المجهز بعينة تركيز غشاء الخلية الفائقة بالوزن الجزيئي 30 ، 000 إلى أقل من 500 ميكرولتر عن طريق الدوران عند 6 ، 000 GS عند 30 درجة مئوية لمدة خمس دقائق تقريبا في دوار بزاوية ثابتة. بعد التخلص من التدفق ، أضف باقي العينات إلى الفلتر.

أحضر الحجم يصل إلى أربعة [تو] خمسة ملليلتر مع [رنس] حرة واحدة [إكست] عازلة. ثم تدور مرة أخرى حتى يتم تحقيق حجم مركز. بعد حوالي خمس دقائق من الدوران ، أضف أربعة إلى خمسة ملليلتر من الحمض النووي الريبي حرر عازلة XTE واحدة إلى المرشح وركزها.

مرة أخرى ، كرر هذا الغسيل وخمس مرات إضافية لتحلية عينات الحمض النووي تماما. بمجرد تركيز العينات بالكامل وتحلية ، قم بنقل عينات الحمض النووي المتبقية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق معقم سعة 1.7 ملليلتر. قم بترسيب الأحماض النووية عن طريق إضافة واحد من 10 من حجم أسيتات الصوديوم ، ومجلدين من 100٪ إيثانول وميكرولتر واحد من الجليكو الأزرق ممزوج جيدا عن طريق جهاز الطرد المركزي الدوامي.

أ 28،000 GS أربع درجات مئوية. 60 دقيقة إلى كينت. تأكد من عدم إزعاج الحبيبات.

أضف 300 ميكرولتر من 70٪ من دوران الإيثانول عند درجة حرارة الغرفة 28،000 GS لمدة 10 دقائق حتى لا يمكن أن يجف ويعيد تعليق كل جزء في حجم مناسب من الحمض النووي الريبي. تم دمج المخزن المؤقت الحر TE بتركيزات متساوية من الأحماض النووية الفيروسية M 13 MP 18 ، والحمض النووي أحادي الشريطة MS اثنين من الشريطتين القطعتين ، و RNA FI ستة تقطعت بهم السبل ، و RNA و lambda مزدوج تقطعت بهم السبل ، ثم تم فصلها باستخدام كروماتوغرافيا هيدروكسيباتيت كما هو موضح في هذا الفيديو. تم دمج تركيزات متساوية من M 13 MP 18 ، DNA أحادي الشريطة MS اثنين ، أحادي الشريطة ، RNA خمسة ستة تقطعت بهم السبل ، RNA و Lambda مزدوج تقطعت بهم السبل ، كما هو موضح في الممر السادس وتم تطبيقه على عمود هيدروكسيباتيت كما يتضح هنا.

تم التلميح إلى الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل والحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل بشكل مستقل من عمود هيدروكسيباتيت باستخدام 0.12 مولار و 0.18 مولار و 0.40 مولار و 1.00 مولار من الفوسفات. تم استخدام سلم كيلوبايت واحد لتأكيد أحجام الجينوم. تشير هذه النتائج إلى أنه يمكن استخدام هذه الطريقة لفصل الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل بنجاح الحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل مع أقل من 9٪ ترحيل من جزء إلى آخر.

تم استخدام هذه الطريقة أيضا لفصل الأحماض النووية المعزولة عن مجتمع فيروسي داخل خليج تشيسابيك ، كما هو موضح هنا. تم التلميح بشكل مستقل إلى D-N-A-R-N-A أحادي الشريطة والحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل باستخدام تركيزات عازلة للفوسفات تبلغ 0.12 مولار و 0.20 مولار و 0.40 مولار ، أو 1.00 مولار على التوالي ، تم استخدام سلم الحمض النووي عالي الكتلة في الممر الأول وسلم كيلو بايت واحد في الممر الثاني لتأكيد الوزن الجزيئي التقريبي وكتلة الأحماض النووية بصريا كما يتضح هنا ، كان الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل هو نوع الحمض النووي السائد المستخرج من عوالق خليج تشيسابيك فيريو. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية فصل الأحماض النووية عن مجموعة فيروسية مختلطة باستخدام كروماتوغرافيا هيدروكسيباتيت.

يتضمن ذلك تحضير عمود هيدروكسيباتيت والأحماض النووية ، وفصل ووهم الأحماض النووية باستخدام تركيزات مختلفة من عازلة الفوسفات وتحلية المياه ، وتركيز الأحماض النووية بعد الانفصال.