حفز الكميات وتحليل تشكيل HO - نوكلياز داخلية Translocations الصبغية التي ستراند ، واحدة في التخمير السكيراء الجعوية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد التحكم الجيني لتكوين الإزاحة عن طريق الركوع المفردة التي تقطعت بهم السبل في خلايا الخميرة الناشئة ثنائية الصبغيات. يتم تحقيق ذلك عن طريق تلقيح الثقافات أولا بمستعمرات مفردة من نمط وراثي معين وزراعتها بين عشية وضحاها. تتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في تحفيز تكوين كسر الخيط المزدوج المتزامن بواسطة نوكلياز داخلي على كروموسومين عن طريق إضافة الجالاكتوز إلى الثقافات.

التخفيف التالي لهذه الثقافات على وسائط انتقائية وغير انتقائية. الخطوة الأخيرة هي تحديد تردد الإزاحة عن طريق عد المستعمرات الناشئة على الوسائط الانتقائية وغير الانتقائية. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر التحكم الجيني في تكوين الإزاحة بواسطة خيط واحد ، والركوع من خلال التغيرات في تواتر تكوين الإزاحة المحفز في سلالات من الأنماط الجينية المختلفة.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى عواقب التعرض للإشعاع العلاجي لمرضى السرطان لأن فواصل الحمض النووي المزدوج وتشكيل الإزاحة هي العواقب الأساسية لهذا العلاج العلاجي. لبدء إجراء تحديد ترددات الإزاحة المحفزة ho ، قم بتلقيح 10 إلى 20 ثقافة مستقلة سعة مليلتر واحد من وسط لاكتات الجلسرين الذروة Y مع مستعمرات مفردة من النمط الجيني المطلوب ، احتضان الثقافات بين عشية وضحاها عند 30 درجة مئوية على المدور. عندما تصل الثقافات إلى كثافة الخلايا المطلوبة ، أضف 20٪ من الجالاكتوز إلى الثقافات إلى التركيز النهائي بنسبة 2٪ ، سيحفز الجالاكتوز التعبير عن نوكلياز داخلي ho ، والذي سيوجه فواصل الخيط المزدوج في دلتا التاريخ خمسة أليل أولي على الكروموسوم الثالث وله ثلاثة دلتا ثلاثة أليل أولي على الكروموسوم 15 يحتضن لمدة أربع ساعات عند 30 درجة مئوية على المدور.

الخطوة التالية حاسمة لنجاح الإجراء. التخفيف الدقيق والطلاء للثقافات أمر حتمي. إذا كنت ستحصل على ترددات نقل قابلة للتكرار بما فيه الكفاية للسماح بمقارنات ذات دلالة إحصائية بين سلالات من النمط الجيني المختلف بعد أربع ساعات ، قم بتخفيف الثقافات المناسبة على وسط يفتقر إلى الهيستيدين وكذلك على YPD td ، ما يقرب من 100 إلى 200 مستعمرة لكل صفيحة ، احتضان الصفائح عند 30 درجة مئوية لمدة يومين إلى ثلاثة أيام.

عندما تنشأ المستعمرات ، يمكن تحديد تردد النقل. ستشير كفاءات الطلاء قبل وبعد تحريض تعبير نوكلياز الداخل إلى ما إذا كان وجود أو عدم وجود أي من كروموسومي الإزاحة يؤثر على القدرة على البقاء على قيد الحياة في تكوين DSB. هذا يجزئ نسخة واحدة من كل من الكروموسوم الثالث والكروموسوم 15 لتحديد كفاءات الطلاء قبل الحث.

أولا ، قم بإزالة حصة من الخلايا من كل ثقافة ليلية وحدد عدد الخلية عن طريق العد باستخدام مقياس الخلوي الدموي. بعد ذلك ، استخدم مخففا مناسبا لوضع ما يقرب من 100 إلى 200 خلية على YPD تحتضن لمدة يومين إلى ثلاثة أيام عند 30 درجة مئوية حتى تنشأ المستعمرات. أضف 20٪ من الجالاكتوز إلى المزارع المتبقية إلى تركيز نهائي قدره 2٪ واحتضان 30 درجة مئوية لمدة أربع ساعات لتحديد كفاءة الطلاء بعد الحث.

قم بإزالة كمية من الخلايا من كل مزرعة بعد أربع ساعات من التحريض وتحديد عدد الخلية بواسطة مقياس العصب الخلوي ، لوحة العد ما يقرب من 100 إلى 200 خلية باستخدام تخفيف مناسب على YPD ، احتضان لمدة يومين إلى ثلاثة أيام عند 30 درجة مئوية حتى تنشأ المستعمرات. بمجرد ظهور المستعمرات على الألواح ، يمكن تحديد كفاءة الطلاء. يمكن فحص المستنسخة الحاملة للنقل المفترضة بواسطة اللطخة الجنوبية.

يستخدم هذا الإجراء الحمض النووي الجيني المحضر من هسهسة واحدة بالإضافة إلى مستعمرة مؤتلفة من كل تجربة مستقلة ، وهضم ما يقرب من أربعة ميكروغرامات من كل عينة من الحمض النووي مع BAM H ، ونوكلياز داخلي واحد مقيد منفصل BAM H ، وواحد شظايا مهضومة على 0.7٪ ، ثم يتم نقلها إلى غشاء نايلون موجب الشحنة مهجن باستخدام مسبار مسمى P 32 تم الحصول عليه عن طريق فتيلة عشوائية باستخدام 1.8 كيلو قاعدة BMH واحد BMH واحد استنساخ جيني واحد يحتوي على HIS ثلاثة جينات. تصور شظايا الحمض النووي عن طريق التصوير الشعاعي التلقائي أو التصوير الفوسفو. هناك طريقة أخرى لفحص المستنسخة الحاملة للانتقال المفترضة وهي تحليل مؤامرة الكروموسوم.

يتم تحضير الكروموسومات أولا من همسة مختارة بالإضافة إلى المؤتلفات في سدادات aros ، أو الكروموسومات المنفصلة على هلام aros بنسبة 1٪ ، في مجال كهربائي متجانس أو طاه مثبت بالكفاف عند 14 درجة مئوية. تستخدم المعلمات التالية الكتلة الأولى 14 درجة مئوية ، ووقت التبديل 72 و 15 ساعة عند ستة فولت سنتيمتر ، والكتلة الثانية ، و 14 درجة مئوية ، و 122 وقت التبديل و 11 ساعة عند ستة فولت لكل سنتيمتر. عند الانتهاء من الرحلان الكهربائي ، تصور الكروموسومات عن طريق تلطيخ الجل ببروميد AUM لمدة 30 دقيقة ، متبوعا بالإشعاع بالأشعة فوق البنفسجية واحتجاز الكروموسومات المنقولة بالماء المقطر إلى غشاء موجب الشحنة عن طريق العمل الشعري.

تهجين ظروف تغيير الطبيعة باستخدام مسبار المسمى P 32 الذي تم الحصول عليه عن طريق التحضير العشوائي باستخدام 1.8 كيلو قاعدة bam H واحد bam H استنساخ جيني واحد يحتوي على الهسهسة. ثلاثة جينات تصور الكروموسومات عن طريق التصوير الشعاعي التلقائي أو التصوير الفوسفو. يمكن حساب تواتر عمليات نقل الكروموسومات بقسمة عدد مستعمرات الهيستامين الضوئية على العدد الإجمالي للخلايا القابلة للحياة التي يتم تحديدها عن طريق الطلاء على YPD.

في هذا المثال ، يبلغ تردد إعادة التركيب المحسوب حوالي 3٪ يمكن إجراء اختبار ترددات الإزاحة المحفزة باستخدام سلالات من الأنماط الجينية المختلفة لمقارنة الاختلافات في القدرة على إصلاح فواصل الخيوط المزدوجة بواسطة خيط واحد. الركوع كما هو موضح في هذا الرسم البياني التمثيلي. كانت ترددات الإزاحة التي تم الحصول عليها بشكل انتقائي وغير انتقائي باستخدام متماثل الزيجوت الفارغ RAD 51 دلتا مختلفة إحصائيا عن تلك التي تم الحصول عليها باستخدام الظروف المقابلة مع سلالة النوع البري على حد سواء الطلاء قبل وبعد الحث.

يتم تحديد الكفاءات بقسمة العدد الإجمالي لخلايا تكوين المستعمرات القابلة للحياة على العدد الإجمالي لأجسام الخلايا في الثقافة التي يحددها عدد مقياس الخلوي الدموي كما هو موضح في هذا الجدول قبل وبعد التحريض. لم تكن الكفاءات مختلفة بشكل كبير بالنسبة للخلايا البرية ، مما يشير إلى أن وجود أو عدم وجود أي من كروموسومي الانتقال لا يؤثر على القدرة على البقاء على قيد الحياة. تشكيل DSB.

يمكن فحص المستنسخة الحاملة للنقل المفترض عن طريق تحليل اللطخة الجنوبية الجينومية. يظهر هنا تمثيل رسومي للكروموسومات ذات الصلة قبل تكوين الإزاحة وبعده. أحجام شظايا التقييد التي تحتوي على التسلسلات ذات الصلة الناتجة عن BAM H هضم واحد للحمض النووي الجيني من السلالات الأم والمؤتلفة وتم الكشف عنها على البقع عن طريق التهجين مع 1.8 كيلو قاعدة BAM H.

سرد استنساخه الجيني الثلاثة في أزواج كيلو بيز لتحليل اللطخة الجنوبية. يتم هضم الحمض النووي الجيني باستخدام نوكلياز داخلي BMH واحد ويتم تهجينه إلى P 32 المسمى 1.8 كيلوقاعدة. مسبار HIS الثلاثة لتصور هذه الأجزاء التشخيصية.

0.8 كيلو قاعدة HIS ثلاثة دلتا 201.7 كيلو قاعدة هسهسة ثلاثة دلتا ثلاثة أولية أربعة كيلو قاعدة T 3 15 5 كيلو قاعدة T 15 ثلاثة وثمانية كيلو قاعدة هسهسة ثلاثة دلتا خمسة شظايا أولية. المسار A هو ثنائي الصبغيات الأصلي. الممر B هو همسة بالإضافة إلى إعادة الإزاحة غير المتبادلة والممر C هو نقل متبادل زائد.

يمكن أيضا استخدام تحليل BLO الكروموسومي المؤتلف لفحص المستنسخة الحاملة للإزاحة. يتم فصل الكروموسومات السليمة المحضرة في سدادات aros عن طريق الرحلان الكهربائي للطاهي والهلام الملطخ ببروميد الإيريديوم ويتم تصورها تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. ثم يتم مسح الكروموسومات المنفصلة إلى النايلون وتهجينها باستخدام P 32 المسمى 1.8 كيلو قاعدة.

مسباراته الثلاثة لتصور الكروموسوم السليم 1.1 ميجا قاعدة 15.8 ميجا قاعدة T 15 ثلاثة كروموسوم إزاحة 0.6 ميجا قاعدة T ثلاثة كروموسوم نقل 15 و 0.3 ميجا قاعدة سليمة كروموسوم ثلاثة. المسار A هو الأصل الذي تم نشره. المسار B هو A بالإضافة إلى الإزاحة غير المتبادلة المؤتلف ، والمسار C هو مؤتلف الإزاحة المتبادلة الزائدة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد تكرار تكوين الإزاحة بعد فواصل الخيوط المزدوجة المتعددة المحفزة.