تحليل هياكل الأميلويد في قسم الأنسجة باستخدام الفحص المجهري للتصوير مدى الحياة الفلورية

خذ قسما من الأنسجة مع مجاميع الأميلويد التي تمثل رواسب بروتين غير طبيعية.

الأنسجة ملطخة بصبغة الفلورسنت حمض الخليك thiophene heptamer-formyl أو hFTAA، والتي ترتبط على وجه التحديد بهياكل صفائح بيتا من ألياف الأميلويد.

قم بتصوير الشريحة باستخدام مجهر متحد البؤر مزود بوحدة مجهرية للتصوير مدى الحياة الفلورية ، والتي تقيس العمر الفلوري لجزيئات الصبغة.

تحسين إعدادات المجهر للإثارة الفعالة لجزيئات الصبغة.

عندما يضيء ضوء الليزر الأنسجة، يثير hFTAA ويتألق.

يؤدي ربط الصبغة الأقوى في الهياكل المدمجة إلى عمر أطول، بينما يؤدي ربط الصبغة الأضعف في الهياكل الأقل إحكاما إلى أقصر العمر.

لاحقا، يقوم البرنامج بإنشاء صورة مرمزة بالألوان للمجموع.

تظهر الألوان، مثل الأحمر والأصفر، في المحيط، مما يشير إلى أقصر عمر مضان يعكس هياكل أميلويد أقل إحكاما وغير مستقرة.

بينما تمثل الألوان مثل الأزرق والأخضر في النواة عمرا أطول للتألق ، مما يعكس هياكل أميلويد أكثر إحكاما واستقرارا.

في يوم التلوين ، اغمر الأقسام في حمامات متتالية من 99٪ إيثانول و 70٪ إيثانول و dH_2O و PBS لمدة 10 دقائق في كل مرة ، ثم اترك أقسام الأنسجة تجف في ظل الظروف المحيطة. أثناء جفاف الأنسجة ، قم بإعداد محلول عملي ل HFTAA عن طريق تخفيف المخزون من 1 إلى 10,000 في PBS. عندما يجف النسيج ، أضف قطرات من محلول عمل HFTTAA إلى كل قسم من أقسام الأنسجة لتغطيته. احتضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

اشطف محلول التلوين ب 500 ميكرولتر من PBS ، ثم اغمر الشريحة في حمام PBS لمدة 10 دقائق. بعد السماح للقسم بالجفاف في ظل الظروف المحيطة ، قم بالتركيب باستخدام وسيط تركيب الفلورة. اسمح لوسط التركيب بالاستقرار طوال الليل.

يمكن إجراء الكشف عن الأميلويد مباشرة بعد التركيب أو حتى بدون تركيب. ومع ذلك ، إذا كان الهدف من التجربة هو جمع معلومات طيفية عالية الجودة ، يفضل الحضانة بين عشية وضحاها.

قم بتبديل المجهر إلى وضع FLIM ، واضبط الثقب على 20 ، والطول الموجي للإثارة على 490 نانومتر ، وشدة الليزر على 0.5٪. استخدم الليزر النبضي عند 40 ميغا هرتز. في برنامج FLIM ، قم بإعداد عد الفوتون الذي يزيد عن 550 نانومتر. في نافذة معلمات العرض ، اتبع عد الفوتون حتى يصل الحد الأقصى للعدد إلى حوالي 4,000 عدد فوتون. احفظ الملف وقم بتصديره كصورة SPC.