تصوير تهريب بروتين GLUT4 في الخلايا العصبية الأولية للفئران باستخدام الفحص المجهري لإزالة الالتواء

ابدأ بالخلايا العصبية الأولية تحت المهاد من النوع البري و CCR5-knockout المزروعة على أغطية مطلية ب-poly-D-lysine في صفيحة متعددة الآبار.

تعبر هذه الخلايا العصبية عن ناقل الجلوكوز المميز بالبروتين الفلوري الأخضر -4 (GFP-GLUT4) في السيتوبلازم.

انقل الغطاء على شرائح زجاجية وامسح الوسط الزائد برفق لضمان الاستقرار أثناء الحصول على الصورة.

ضع شريحة على مرحلة مجهر الالتفاف بحيث يكون الغطاء متجها لأسفل.

تصور الخلايا العصبية تحت إضاءة المجال الساطع ، ثم عالجها باستخدام الكيموكين CCL5 والأنسولين بالتتابع.

قم بالتبديل إلى الإضاءة الفلورية لتحديد الخلايا العصبية المستهدفة التي تعبر عن GFP-GLUT4 وضبط معلمات التصوير لالتقاط صور الفلورسنت الحية.

في الخلايا العصبية من النوع البري ، يرتبط الأنسولين و CCL5 بمستقبلات الأنسولين و CCR5 ، على التوالي ، مما يؤدي إلى تنشيط مسارات الإشارات النهائية التي تدفع نقل غشاء GFP-GLUT4.

في الخلايا العصبية CCR5-knockout ، يفشل CCL5 في الارتباط ، مما يؤدي إلى تقليل نقل GFP-GLUT4.

التقط الصور وقم بتطبيق خوارزمية فك الالتفاف لتقليل الضوء خارج نطاق التركيز البؤري ، مما يعزز وضوح الصورة ودقتها.

لتحضير الخلايا للتصوير الحي ، قم بإزالة الغطاءات بعناية باستخدام الخلايا العصبية باستخدام الملقط وضعها على الشريحة الزجاجية بحذر. ثم قم بإزالة الوسيط الزائد باستخدام مناديل مهمة دقيقة عن