التحليل المجهري للمشابك في شرائح الحصين الفأرية باستخدام التألق المناعي

ضع شريحة الحصين من دماغ الفأر في بئر يحتوي على مخزن مؤقت. تحتوي الشريحة على شبكة من الخلايا العصبية التي تتواصل من خلال نقاط الاشتباك العصبي.

تحتوي أطراف الخلايا العصبية قبل المشبكية على حويصلات مملوءة بالناقلات العصبية ذات ناقلات الغشاء المميزة ، بينما تتميز أطراف ما بعد المشبكي ببروتينات سقالة مميزة تنظم مستقبلات الناقل العصبي. كلاهما بمثابة علامات رئيسية للهياكل المتشابكة.

استبدل المخزن المؤقت بمحلول مانع للنفاذية واحتضانه بالتحريض لاختراق الأغشية الخلوية ومنع مواقع الربط غير المحددة.

أضف الأجسام المضادة الأولية التي تستهدف علامات ما قبل المشبكي وما بعد المشبكي واحتضانها بالتحريض للسماح بالارتباط.

اغسل الشريحة، وأضف الأجسام المضادة الثانوية المترافقة بالفلوروفور الخاصة بالأجسام المضادة الأولية، واحتضن بالتحريض في الظلام.

اغسل الشريحة ثم قم بتثبيتها على شريحة.

باستخدام مجهر متحد البؤر ، حدد منطقة الاهتمام وقم بتكبيرها لتصور نقاط الاشتباك العصبي.

التقط الصور لتحديد علامات ما قبل المشبكي وما بعد المشبكي المصنفة بالفلورسنت وتقييم توسيطها المشترك في نقاط الاشتباك العصبي.

لبدء تلطيخ التألق المناعي ، استبدل PBS في آبار الشرائح بمخزن مؤقت مانع ونفاذة ، واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 4 إلى 6 ساعات على شاكر. قرب نهاية خطوة الحجب ، قم بتخفيف الجسم المضاد إلى VGLUT1 1 إلى 2000 في المخزن المؤقت للحجب والنفاذ. يرجى ملاحظة أن هذا التخفيف قد يختلف اعتمادا على الشركة والكثير من الجسم المضاد المستخدم. احتضان الشرائح في محلول الجسم المضاد الأساسي طوال الليل عند 4 درجات مئوية. استخدم منصة اهتزاز بحركة قوية.

يعد التوزيع المتساوي للأجسام المضادة الأولية والثانوية أمرا مهما للتلوين الأمثل. في تجربتنا ، يتيح الاهتزاز القوي أفضل اختراق للأجسام المضادة.

بعد الحضانة في الجسم المضاد الأولي ، اغسل الشرائح ثلاث مرات في PBS لمدة 10 دقائق في كل مرة كما كان من قبل. أثناء الغسيل الأخير ، قم بتخفيف الأجسام المضادة الثانوية المناسبة من 1 إلى 500 في المخزن المؤقت المانع. ثم احتضان الشرائح في هذا المحلول لمدة 2 إلى 3 ساعات في درجة حرارة الغرفة. تأكد من حماية الشرائح من الضوء ، لأن الأجسام المضادة الثانوية حساسة للضوء.

بعد غسل الشرائح كما كان من قبل ، استخدم فرشاة لإزالة الشرائح بعناية من الطبق المكون من 24 بئرا ووضعها بالتساوي على شرائح زجاجية مسبقة الإعلان. أضف قطرة من وسط التثبيت فوق كل شريحة. ثم ضع غطاء زجاجي برفق فوق الشرائح ، مع الحرص على تجنب تكوين فقاعات الهواء.

احميها من الضوء واترك الشرائح تجف لمدة لا تقل عن ثلاثة إلى أربعة أيام في درجة حرارة الغرفة. قم بتخزين الشرائح على حرارة 4 درجات مئوية على المدى القصير. ولكن للتخزين طويل الأجل ، احتفظ بها عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. ابدأ باستخدام هدف 10x أو 20x لتحديد منطقة الحصين المراد تصويرها - في هذه الحالة ، نقاط الاشتباك العصبي بين الخلايا العصبية الهرمية CA1 والمحاور الجانبية لشافر.

قم بالتغيير إلى هدف غمر الزيت 40x أو 63x وتأكد من أن تشريح الشريحة سليم من خلال تحديد الخلايا العصبية المستمرة والبنية المنظمة. استخدم علامة عصبية ، مثل MAP2 ، كمرجع. اضبط الإعدادات لكل قناة للحصول على الإشارة والتباين الأمثل بدقة 1024 × 1024 بكسل. اضبط شدة كل ليزر لتجنب تشبع أي بكسل.

قم بتقييم العمق حيث يكون التلوين متساويا ، ثم اضبط البرنامج للحصول على مجموعات صور من ثماني طائرات متساوية البعد على الأقل 250 نانومتر. ثم التقط ثلاث مجموعات صور تمثيلية متجاورة من نفس مجال الاهتمام لكل شريحة. كرر الاستحواذ في ثلاث شرائح على الأقل لكل حالة ومن ستة إلى ثمانية لكل مجموعة علاج.