تصوير تنشيط الخلايا العصبية في الحصين في أقسام دماغ الفئران

ابدأ بأقسام دماغ الفأر التي تعرض الحصين الظهري، الغني بالخلايا العصبية.

أضف بيروكسيد الهيدروجين لإخماد نشاط البيروكسيديز العصبي، متبوعا بالغسيل.

تعامل مع مخزن مؤقت للنفاذية، ثم قم بتطبيق مخزن مؤقت للحظر لمنع الربط غير المحدد.

أضف الأجسام المضادة الأولية واحتضن بالتحريض. ترتبط هذه الأجسام المضادة ببروتينات علامة تنشيط الخلايا العصبية.

اغسل واستخدم الأجسام المضادة الثانوية المقترنة بالبيوتين لربط الأجسام المضادة الأولية. <

اغسل مرة أخرى، ثم أضف ركيزة كروموجينيكية، والتي تتأكسد بواسطة البيروكسيداز لتوليد راسب بني. أوقف التفاعل مع PBS.

انقل الأقسام إلى شريحة مغلفة بالجيلاتين وقم بتجفيفها باستخدام تركيزات متزايدة من الإيثانول. ثم امسح الأقسام في الزيلين وقم بتركيبها.

ضع الشريحة تحت مجهر المجال الساطع.

تحت الإضاءة الخفيفة، تنقل المناطق غير الملطخة الضوء وتظهر ساطعة، بينما تمتص الخلايا العصبية الملطخة الضوء وتعكس الضوء وتبدو أغمق.

تشير المنطقة الداكنة المميزة إلى تنشيط الخلايا العصبية داخل الحصين.

انقل ثلاثة إلى خمسة أقسام من الحصين الظهري لكل فأر إلى آبار صفيحة متعددة البئر 24 تحتوي على 500 ميكرولتر من 0.1 مولار PBS لكل بئر. اغسل الأقسام الموجودة في كل بئر ب 500 ميكرولتر من 0.1 مولار PBS. قم بإجراء جميع عمليات الغسيل والحضانات في درجة حرارة الغرفة مع تحريض لطيف ، ما لم يذكر خلاف ذلك. تحت غطاء الدخان ، احتضان الأقسام في 40٪ ميثانول ، 1٪ بيروكسيد الهيدروجين في 0.1 مولار PBS لمدة 20 دقيقة من أجل إخماد نشاط البيروكسيديز الداخلي.

بعد ثلاث غسلات أخرى في 0.1 مولار PBS ، قم باختراق الأقسام عن طريق احتضانها في 500 ميكرولتر من 0.2٪ Triton X-100 لمدة خمس دقائق. أثناء احتضان الأقسام ، قم بإعداد مخزن مؤقت مانع كاف للتجربة بأكملها. ثم قم بإزالة محلول النفاذية وأضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحجب إلى كل بئر. احتضان الأقسام لمدة ساعة واحدة.

بعد ذلك ، قم بإزالة المخزن المؤقت المانع وقم بتغطية الأقسام بجسم كيناز أساسي منظم خارج الخلية المفسفرة ، مخفف من 1 إلى 500 في المخزن المؤقت للحظر. احتضان الأقسام بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية مع تحريك لطيف. في اليوم التالي ، بعد غسل الأقسام ثلاث مرات في 0.1 مولار PBS لمدة 5 دقائق لكل منها ، احتضان الأقسام بجسم مضاد ثانوي مترافق بالبيوتين مخفف من 1 إلى 250 مانع مانع لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

أثناء الحضانة ، قم بإعداد كاشف ABC قبل 30 دقيقة على الأقل من الاستخدام لإتاحة الوقت الكافي لتكوين مركب أفيدين والبيوتين. بعد غسل الأقسام ثلاث مرات أخرى باستخدام 0.1 مولار PBS ، أضف كاشف ABC ، واتركه يحتضن مع العينة لمدة 45 دقيقة. خلال المجموعة التالية المكونة من ثلاث غسلات في PBS ، قم بإعداد محلول العمل في غطاء الدخان وفقا لمواصفات الشركة المصنعة. Aliquot حل العمل dab في اللوحة.

بعد ذلك ، قم بنقل الأقسام إلى الآبار التي تحتوي على محلول عمل DAB ، وقم بتدوير اللوحة ببطء للسماح بأقصى قدر من التعرض للأقسام للمحلول. راقب تفاعل DAB على المجهر حتى تتطور الإشارة الكافية في حوالي دقيقتين إلى خمس دقائق. أوقف التفاعل بكثافة اللون المطلوبة عن طريق غسل الأنسجة في 0.1 مولار PBS. بعد ثلاث غسلات أخرى في PBS ، قم بتركيب الأقسام على شرائح مغلفة بالجيلاتين ، وجففها في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث إلى أربع ساعات على الأقل.

بمجرد أن تجف في الهواء ، انقل الشرائح في غطاء الدخان ، وقم بتجفيف الأقسام عن طريق وضعها بالتتابع في محاليل الإيثانول المتدرجة لمدة دقيقتين لكل منها. بعد ذلك ، امسح الشرائح في زيلين 100٪ لمدة خمس دقائق. قم بتغطية الشرائح باستخدام وسيط التثبيت ، واتركها في غطاء الدخان طوال الليل حتى تجف.

انقل الشرائح إلى مجهر المجال الساطع المزود بكاميرا في عدسة موضوعية 20x. احصل على صور متعددة للمجال الساطع من كل قسم بتكبير 200x ، تغطي الحصين الظهري. صورة ثلاثة إلى خمسة أقسام من كل.