تصوير الفوتون في الجسم الحي لشبكية العين الفأر

خذ فأرا معدلا وراثيا مخدرا مع تثبيت رأسه بزاوية على حامل للتصوير في الجسم الحي لشبكية الفأر.

تحتوي شبكية العين على خلايا عقدية شبكية العينية، أو RGCs، تعبر عن بروتين يحمل علامة بالفلوروفور.

ضع زيوت تشحيم العين وقم بتركيب غطاء على العين.

تحت المجهر ، قم بإضاءة شبكية العين بشكل موحد لإثارة البروتينات الفلورية في RGCs.

باستخدام التألق المنبعث ، احصل على عرض واسع النطاق للمستوى البؤري RGCs و RGCs خارج نطاق التركيز.

قم بالتبديل إلى وضع التصوير ثنائي الفوتون، مع التركيز على ضوء الأشعة تحت الحمراء القريبة منخفض الطاقة في طبقة RGC.

عند النقطة المحورية ، تثير الطاقة المجمعة من فوتونين الفلوروفور ، والذي يطلق الطاقة بعد ذلك على شكل تألق.

نظرا لأن الإثارة تقتصر على نقطة واحدة، يتم تقليل التألق من المستويات البؤرية الأخرى.

التقط صورا على مستويات بؤرية متعددة على طول المحور z لتصوير طبقة RGC بأكملها.

ضع قطرات العين المزلقة على كلتا عيني الفأر. قم بتدوير الذراع الرئيسي لحامل الرأس حتى يتم توجيه تلميذ العين بما يتماشى مع مسار الضوء ، وضع غطاء رقم 1.5 في حامل الفلتر المضغوط. بعد تثبيت الحامل في مرحلة المجهر ، قم بخفض الغطاء حتى يلامس زيت التشحيم i-gel دون لمس القرنية. واضبط المرحلة في البعد xy وموضع z الهدف حتى يغطي ضوء الإثارة العريض القرنية بالكامل.

استخدم العدسة لمواصلة ضبط موضع z ، حتى يتم التركيز على الخلايا الفلورية أو الهياكل في شبكية العين ، مما يزيد من إضاءة التألق حسب الضرورة لحل الخلايا الفردية أو الهياكل ذات الأهمية. ضبط محاذاة شبكية العين مع مسار ضوء التصوير. اضبط زاوية الرأس حتى يحدث تمدد أو انكماش للضوء خارج نطاق التركيز البؤري فقط عند تغيير المستوى البؤري ، مما يقلل من تشوهات xy.

ثم قم بإيقاف تشغيل مصباح التألق العرضي وأغلق مصراع الإضاءة. للتصوير ثنائي الفوتون ، اتبع جميع بروتوكولات سلامة الليزر المؤسسية. قم بإيقاف تشغيل وتغطية كل الضوء المحيط وقم بتبديل مسار ضوء الإثارة إلى الليزر ومسار ضوء الانبعاث إلى PMTs.

في برنامج الحصول على الصور ، اضبط حجم الإطار على 512 × 512 ومتوسط الإطار إلى 3. اضبط z-stepping للبدء في الجزء العلوي من المكدس والتقدم لأسفل ، مما يقلل من تنشيط الليزر ثنائي الفوتون للمستقبلات الضوئية. قم بتشغيل وتمكين PMTs ، واضبط الجهد على 680 فولت.

قم بتمكين مصاريع التصوير والانبعاثات. ابدأ معاينة صورة حية للأنسجة المستهدفة بدءا من طاقة ليزر 1٪ ، واضبط سطوع الشاشة تلقائيا لتصور الخلايا أو الهياكل ذات الاهتمام. إذا كانت الأنسجة المستهدفة قاتمة أو غير واضحة ، فقم بزيادة نسبة طاقة الليزر حتى تصبح الهياكل مرئية دون تجاوز 45 مللي واط.

قم بمناورة مرحلة المجهر في الاتجاه xy لتمركز في منطقة التصوير المرغوبة ، وانتقل إلى المستوى z ، مع التركيز على الهياكل ذات الاهتمام. بالنسبة لتجربة الفاصل الزمني المزمن ، افتح صورة تم الحصول عليها مسبقا لاستخدامها كمرجع للخلايا ذات الأهمية ، مع الحرص على أن تكون زاوية التصوير في الصورة الحالية مشابهة لزاوية الصور السابقة. ثم انتقل إلى مستويات z العلوية والسفلية ذات الأهمية لتعيين حدود z لمكدس التصوير والحصول على الصورة.