التصوير الفلوري لديناميكيات الكالسيوم عند التقاطعات العصبية العضلية في الحجاب الحاجز للفأر المعدل وراثيا

ابدأ بإعداد مجهر مضان يحتوي على غشاء ثابت مع أعصاب فرينيك من فأر معدل وراثيا.

يتكون الوصلة العصبية العضلية للحجاب الحاجز من خلية عصبية حركية وألياف عضلية وخلايا شوان تحتوي على مستقبلات الأسيتيل كولين وقنوات الكالسيوم.

هذه الخلايا لديها مستقبلات أستيل كولين وصفت بالفلورسنت وعبر عن مؤشرات الكالسيوم داخل الخلايا.

مقسم الصور المتصل بالإعداد التصور المتزامن لكل من إشارتي الفلورسنت.

يتم وضع العصب الحجابي في قطب شفط لإيصال التحفيز الكهربائي.

تحت المجهر الفلوري ، تصور مستقبلات الأسيتيل كولين لتحديد الوصلة العصبية العضلية.

لتعيين أقصى مضان أساسي ، أضف محلول كلوريد البوتاسيوم لإزالة استقطاب غشاء الخلية مؤقتا. يؤدي هذا إلى تدفق الكالسيوم داخل الخلايا ، مما يؤدي إلى زيادة تألق المؤشرات.

اضبط إعدادات السطوع لمنع التشبع المفرط لإشارة التألق.

بعد إعادة الاستقطاب ، قم بتطبيق المحفزات الكهربائية لتحفيز تدفق الكالسيوم إلى الخلية وتسجيل التغيير في التألق داخل الخلايا بمعدل إطارات مرتفع.

عند تكبير 20 مرة ، حدد موقع شريط اللوحة الطرفية في مركز العضلات من خلال البحث عن التقاطعات العصبية العضلية ألفا-بونجاروتوكسين المسماة بالفلورسنت تحت إثارة الضوء الأصفر الأخضر. قم بالتبديل إلى إثارة الضوء الأزرق لتصوير استجابات الكالسيوم في خلايا العضلات أو الخلايا العصبية الحركية أو خلايا شوان. في هذا المثال ، يتم التعبير عن GCaMP 3 في خلايا العضلات.

إذا رغبت في ذلك ، قم بإعداد مقسم الصور باستخدام مرشحات ممر النطاق الترددي ومرشح أحادي الحافة ثنائي اللون للتصوير بالطول الموجي المزدوج. قم بإجراء تجارب مع شريط السطوع على شريط جدول البحث ، والذي تم ضبطه على 110٪ من المستوى الذي يظهر عنده مؤشر الكالسيوم المشفر وراثيا الذي يعبر عن الأنسجة تشبعا عند تكبير 20 مرة ، دون التجميع استجابة لكلوريد البوتاسيوم.

سجل بمعدل 20 إطارا في الثانية حتى لا تفوت أي أحداث سريعة. قم بالتحفيز من 1 إلى 45 ثانية من 20 إلى 40 هرتز من تحفيز الأعصاب عن طريق توصيل مجموعة من النبضات باستخدام قطب شفط. وجمع استجابات الكالسيوم الفلورية الديناميكية في نوع فرعي واحد من الخلية ، جنبا إلى جنب مع إشارة التوصيل العصبي العضلي ألفا بونجاروتوكسين الساكنة المسماة بالفلورسنت.