التصوير المجهري متحد البؤر للأشجار المتغصنة السليمة ومورفولوجيا العمود الفقري في دماغ الفأر الذي تم تطهيره

خذ دماغ فأر تم تطهيره مع إزالة الخلايا التي تعبر عن البروتينات الفلورية والدهون من أجل الشفافية لتصوير البنية العميقة بدقة عالية.

تحافظ شبكة الهيدروجيل على الجزيئات الحيوية وتحافظ على الشبكات العصبية.

انقل الدماغ إلى غرفة تصوير تحتوي على حلقة الاغاروز للحصول على الدعم.

قم بتأمين الأنسجة بمادة لاصقة واملأ الغرفة بمحلول مطابقة معامل الانكسار لتقليل تشتت الضوء وخلق بيئة تصوير مستقرة.

ضع الغرفة على مرحلة المجهر متحد البؤر وقم بخفض الهدف برفق في المحلول لإنشاء عمود اتصال مستمر.

استخدم التألق الفائي لتحديد المناطق ذات الاهتمام. بعد ذلك ، اضبط معلمات الليزر والتصوير لتحسين جودة الصورة.

التقط سلسلة من الأكوام z لإنشاء تمثيل ثلاثي الأبعاد للأنسجة.

استخدم البرامج المناسبة لتحليل التشكل الخلوي ، بما في ذلك العرش المتغصنة ، والعمود الفقري ، وتوزيع الخلايا العصبية وكثافتها.

لبناء غرفة تصوير كبيرة للأنسجة للأنسجة التي يزيد سمكها عن 5 ملليمترات ، استخدم طبقا زجاجيا بطول 10 سم بجدار مرتفع. ضع أنبوبا مخروطيا سعة 50 مليلتر في المنتصف ، مع التأكد من أن قطر الأنبوب كبير بما يكفي لقبول برميل العدسة الشيئية المستخدمة. اصنع 3٪ agarose في الماء واسكبه في الفراغ بين الطبق الزجاجي والأنبوب المخروطي.

ثم اتركه ليبرد لمدة ساعة. سيشكل هذا حلقة من الاغاروز الصلب. قم بلصق الأنسجة بإحكام في قاع الغرفة باستخدام الغراء الفائق ، واملأ الغرفة بمحلول مطابقة معامل الانكسار ، والذي قد يبدأ في البلمرة ما لم يتم حفظه من الهواء وتخزينه عند 4 درجات مئوية. احصل على الصورة باستخدام مجهر متحد البؤر.

قم بتشغيل جميع معدات التصوير ذات الصلة. ضع العينة على المسرح. اقترب بعناية من وسائط الغمر مع الهدف وشكل عمودا مستمرا من الوسائط. باستخدام التألق العرضي ، ابحث عن مجال تصوير مناسب. ابدأ بضبط إعدادات الدقة وسرعة المسح.

في حالة التصوير باستخدام مجهر متحد البؤر ، أغلق الثقب بالكامل للحصول على أصغر قسم بصري وبالتالي أفضل دقة Z. قم بزيادة طاقة الليزر أو كسب المستشعر تدريجيا حتى يتم الحصول على صورة مناسبة بنسبة إشارة إلى ضوضاء عالية. إذا كنت تستخدم EGFP القياسي أو tdTomato تصويرا بلونين ، فقم بتعيين إعدادات مجموعة الضوء.

قم بتعيين معلمات المكدس Z استنادا إلى البداية ونقاط النهاية المرصودة للنسجة. قم بتعيين حجم الخطوة بناء على دقة Z المطلوبة. ستؤدي أحجام الخطوات الأصغر إلى دقة Z أكبر ، ولكنها قد تؤدي إلى تبييض العينة.

عندما تكون راضيا عن إعدادات الحصول على الصورة ، احصل على الصورة. تأكد من أن الصورة تحتوي على نسبة إشارة إلى ضوضاء عالية ، وتظهر حدودا مميزة للهياكل.