الفحص المجهري ثنائي الفوتون للخلايا النجمية والخلايا العصبية المثيرة في أنسجة الحصين الفأرية التي تم تطهيرها

ابدأ بأنسجة الحصين الفأر التي تم تطهيرها والتي أصبحت شفافة بصريا عن طريق إزالة الدهون. يتم تضمين الأنسجة في شبكة هيدروجيل لتثبيت الجزيئات الحيوية والحفاظ على الهياكل الخلوية.

يحتوي النسيج على خلايا نجمية تعبر عن البروتين الفلوري الأحمر والخلايا العصبية المثيرة التي تعبر عن البروتين النووي الأخضر ، مما يتيح التصور المميز.

ضع الأنسجة على شريحة وقم بإنشاء حجرة باستخدام الغراء الساخن ، مع ترك فجوة صغيرة.

ضع محلول مطابقة معامل الانكسار لترطيب الأنسجة ومنع الفقاعات ، ثم أغلقها بغطاء غطاء.

املأ الغرفة بمحلول مطابقة معامل الانكسار لتقليل تشتت الضوء وسد الفجوة.

تصور الأنسجة باستخدام مجهر ثنائي الفوتون.

يثير ضوء الأشعة تحت الحمراء القريبة البروتينات الفلورية الحمراء والخضراء في المستوى البؤري ، مما يتيح التصوير عالي الدقة مع الحد الأدنى من التلف الضوئي. يتم الكشف عن انبعاثات التألق بشكل منفصل ، مما يكشف بوضوح عن القرب المكاني بين الخلايا النجمية ونواة الخلايا العصبية المثيرة.

أولا ، ضع العينة في منتصف الشريحة. باستخدام الغراء الساخن ، قم بإنشاء جدران على حواف الشريحة ، بارتفاع الأنسجة. تأكد من ترك فجوة صغيرة في إحدى الزوايا. عندما تقترب طبقة الغراء الساخن من ارتفاع شريحة الدماغ ، ضع قطرة أو قطرتين من محلول مطابقة معامل الانكسار على العينة لترطيب السطح العلوي ومنع تكوين الفقاعة.

بينما لا يزال الغراء الساخن سائلا ، أغلق الجزء العلوي بغطاء ، وضعه بالتساوي قدر الإمكان. ثم املأ الغرفة بمحلول مطابقة معامل الانكسار. أغلق الفجوة بالغراء الساخن. إذا امتدت جدران الغراء الساخن إلى ما وراء حدود الشريحة ، فقم بقص الحواف الممتدة. إذا تم استخدام هدف الغمر بالزيت للتصوير ، فأضف ملليمترين إلى ثلاثة ملليمترات أخرى من الغراء إلى الجدران فوق الغطاء للاحتفاظ بمحلول الغمر. بعد هذا البروتوكول ، سيتم تنظيف أنسجة المخ.